生物工程下游技术 第三章 微生物细胞破碎课件.ppt

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1、第三章微生物细胞破碎和包含体的复性生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性第一节概述几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠杆菌治疗侏儒病α--干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤细胞破碎（cellrupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯

2、化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。细胞壁的组成和结构（细菌肽聚糖结构示意图）细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；酵母细胞壁的结构示意图破碎酵母细胞壁的阻力酵母细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状

3、结构。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。红面包霉菌(Neurosporacrassa)的细胞壁结构示意图主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以β-1,3糖苷键连接，某些以β-1,6糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。(a)α-和β-葡聚糖的混合物(b)糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来(c)主要是蛋白质(d)主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤

4、维素的纤维状结构，所以强度有所提高。微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白质脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白质葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白质（6-8%）脂类（8.5-13.5%）多聚糖（80-90%）脂类蛋白质第二章细胞破碎技术分类作用机理适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏

5、阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠

6、子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走,但在大型设备中，采用夹套冷却带走热量是一个需要考虑的问题。1.珠磨法（Beadmill）原理：实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器。中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理。在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。Ｄyno珠磨

7、机NetzschLM-20型珠磨机园盘以两种位置交错地安装在轴上，一种处于径向，一种和轴倾斜，径向园盘使磨料沿径向运动，倾斜园盘则产生轴向运动。由于交错的运动，提高了破碎效率。除磨室有冷却夹套外，搅拌轴和园盘也可以冷却。破碎作用方程破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：ln[1/(1-R)]=Kt其中R—破碎率；K一一级反应速度常数；t一时间。一级反应速度常数K与许多操作参数有关，如如搅拌转速、细胞悬浮液的浓度和循环