生物工程下游技术 细胞分离与破碎ppt课件.ppt

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1、Chapter2细胞分离与胞内产物的溶解CellSeparationandExtractionoftheProductTrappedintheBiomass2.1细胞的分离2.2细胞的破碎2.2细胞破碎(cellmill）细胞破碎的目的由于有许多生化物质存在于细胞内部，必须在纯化以前将细胞破碎，使胞内物质释放到液相中，然后方可进行提取Insomecases,theproductsofinterestarenotinthebrothbutareinthebiomass.Itisintracellular.Releasingthistrappedmateria

2、lusuallyinvolvesrupturingthecellwall2.2细胞破碎(cellmill）2.2.1细胞的结构与组成2.2.2细胞破碎技术2.2.3目标产物的选择性释放2.2.4破碎率的评价2.2.5包含体溶解与蛋白质的复性2.2.1细胞的结构与组成革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌酵母真菌革兰氏阳性菌细胞壁革兰氏阴性细胞壁酵母细胞壁细菌细胞壁化学组成肽聚糖糖：N-乙酰葡萄糖胺,N-乙酰胞壁酸,半乳糖胺氨基酸：D-丙氨酸L-丙氨酸D-谷氨酸L谷氨酸磷壁质：聚核糖醇磷酸酯聚甘油磷酸酯糖：葡萄糖，半乳糖，甘露糖脂质:酵母与真菌成分糖及其氨基衍生物：葡萄糖

3、30%甘露糖30%半乳糖岩藻糖葡萄糖胺1-2%氨基酸谷氨酸5-7%天门冬氨酸脂质1-13.5%葡萄粮胺与胞壁酸肽聚糖酵母细胞化学成分2.2.2细胞破碎技术原理：压挤撞击剪切化学渗透压挤剪切化学渗透产物释放2.2.2.1机械破碎高压匀浆珠磨撞击超声高压匀浆1)：结构和原理—高压匀浆器，由高压泵和匀浆阀组成。见图高压匀浆2)影响破碎率的因素见图2.123)适用范围和操作注意点酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到20%左右，团状和丝状及小的G+菌不适。珠磨1)结构与原理---见图2)破碎率动力学方程式3)适用范围和操作注意点大多数微生物的细胞破碎珠磨撞

4、击撞击声频高于15~20KHZ的超声波在高强度声能输入下，利用空化现象(cavitation)引起的冲击波和剪切力使细胞破碎。超声波—气泡形成—气泡长大—破碎超声波的声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型均影响破碎效率。缺点：产生化学自由基团—氧化产物，且噪声大。超声波破碎(Ultrasonication)超声破碎释放方程2.2.2.2化学和生物化学渗透酸碱处理化学试剂酶溶物理渗透渗透压冲击法冻结融化法干燥法2.2.3目标产物的选择性释放(1)仅破坏或破碎目标产物的位置周围(2)选择性溶解目标产物2.2.4破碎率的评价直接计数（1）计数器（2）平板计数（

5、3）显微镜间接计数（1）活性测定（2）电导率测定：破碎后，带电荷的内容物释放，使悬浮液的导电率增加。2.2.5包含体溶解与蛋白质的复性重组DNA技术实现了大规模生产目标蛋白质，但这些基因重组所产生的蛋白质往往互相交联在一起，形成不溶性的聚积物，称包含体(inclusionbodies,Ibs)。2.2.5.2包含体的性质2.2.5.3包含体的形成包含体的形成为动力学控制过程，可用竞争反应动力学描述2.2.5.1包含体的概念U—伸展肽链(unfoldedpeptide);I—折叠中间态；N—天然活性态；A—聚集体(包含体)ki—中间体生成速率常数;kr—折叠

6、速率常数；ka—聚集体生成速率常数U→I→N↓Akikrka1)在折叠反应中，从伸展态到中间体的形成是非常快速的，一般在毫秒范围内完成，但从中间体转变为天然态的过程比较缓慢，是反应的限速步骤。当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助因子(如人工伴侣)存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。2)目前有两种不同的假设：一种假设认为，肽链中的局部肽段先形成一些构象单元，如α螺旋、β折叠、β转角等二级结构，然后再由二级结构单元的组合、排列，形成蛋白质三级结构；另一种假设认为，首先是由肽链内部的疏水相互作用导致一个塌陷过程，然后经逐步调整

7、，形成不同层次的结构。3)当溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。细胞破碎--匀浆离心--回收包含体–加入变性剂溶解包含体--可溶性伸展态--除去变性剂--恢复天然构象及活性2.2.5.4包含体的分离纯化2.2.5.5蛋白质的复性1)回收包含体后，加入变性剂溶解包含体，使之成为可溶性伸展态，再除去变性剂使表达产物折叠恢复天然构象及活性。2)但在实际研究中发现，在体外折叠时，蛋白质分子间由于存在大量错误折叠和聚合，复性效率往往很低。原因是蛋白质的立体结构虽然由其氨基酸顺序决定，然而伸展肽链折

8、叠为天然活性结构的过程还受到周围环境的影响。3)当溶液中离子强度或