【生物工程下游技术】第四章 微生物细胞的破碎.ppt

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1、第四章微生物细胞的破碎知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程及常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。难点：常用破碎方法的合理选用。为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白质脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%

2、）磷脂蛋白质葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白质（6-8%）脂类（8.5-13.5%）多聚糖（80-90%）脂类蛋白质一、细胞壁的组成和结构细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰

3、氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。二、常用破碎方法分类作用机理适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和含有包含体的基因工程菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易

4、分离，但释放率较低，通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活细胞破碎机理图进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。1.珠磨法（Beadmill）原理：高

5、速珠磨机实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。胶体磨德国进口珠磨机采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国Microfluidics公司均有产品出售）。2.高压匀浆法（High-pressurehomogenization）——大规

6、模细胞破碎的常用方法利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。原理：高压匀浆器大、中、小型高压匀浆器在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难破碎，在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培

7、养基上培养的细胞较难破碎。易造成堵塞的团状或丝状真菌较小的革兰氏阳性菌含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）不宜采用高压匀浆法的细胞类型：破碎的动力学方程为：ln[1／（l－R）]＝KNPα其中R——破碎率；K——与温度有关的速度常数；P一操作压力；N一悬浮液通过匀浆器阀的次数。α——与微生物种类有关的常数；破碎酵母菌,α值可取2.2。可见，影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形

8、成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。3.超声破碎法（Ultrasonication）一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差，该法在实验室小规模细胞破碎中常用。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。4.酶溶法（EnzymaticLy