小鼠单抗腹水纯化步骤doc资料.docx

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1、小鼠单抗腹水纯化步骤精品文档小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：0.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰

2、乙酸。0.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100mlddH2O中）2、10*PBS(0.1M,pH7.4)500ml取0.2MPB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2MPB母液250ml：0.2MNa2HPO4202.5ml（折合14.5gNa2HPO4·12H2O）0.2MNaH2PO447.5ml（折合1.482gNaH2PO4·2H2O）3、1MTris——Cl

3、（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1MNaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃

4、静置2h以上，使其充分沉淀。注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。4、12000r/min，4℃，30min，收集上清。5、上清液经普通滤纸过滤1次，加入1/10体积的10*PBS（0.1MpH7.4）用1MNaOH调至7.4，冰浴至4℃。6、根据每ml上述混合液加0.277g固体硫酸铵（0℃条件下，45%饱和硫酸铵为0.291g/ml），冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，不可一次全部加入，而以小分量分多次慢慢溶入，并不时搅拌，以免造成局部浓度过高。缓慢加入时为了避免局部的浓度

5、一下子很高，因为硫酸铵不同的浓度是沉淀不同的蛋白为主，这样就可能将不想沉淀的蛋白沉淀下来。冰浴条件是为了保证蛋白的活性，因为硫酸铵加入到辛酸溶液后会产热。7、硫酸铵全加入后，再搅拌10-30min，使溶液完全平衡，然后就可以进行离心。一般采取4℃搅拌30min后，继续静置至少60min（一般过夜）。再13000r/min，4℃离心30min，弃上清，在短暂离心，将沉淀溶解于少量PBS中。但如果进行下面的亲和层析，可直接将沉淀溶解于1.5ml结合缓冲液中。二、亲和层析【HiTrapProteinAGHP1ml（Am

6、ershamBioscience）特性】柱床体积：1ml柱子大小：0.7*2.5cm耐受压：0.3mPa最大流速：4ml/min建议流速：1ml/min收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档【proteinG】G组链球菌的表面蛋白，属于III型Fc受体，能以非免疫机制的方式结合IgGFc区域。proteinG和IgG在pH7.0时有很强的结合能力，而其结合产物的洗脱一般在pH2.5-3是进行。由于IgG对段敏感，会破坏其生物学活性，故一般在收集管种种加入60-200μl的1MTris-HCl（pH9.0），

7、一般用100μl/ml洗脱液，这样纯化的IgG最终会中和成中性。注意：经pH洗脱后在收集管内欲置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。小鼠IgG单克隆抗体溶液在280nm时。1.44（吸光单位）相当于1mg/ml。【缓冲液准备】1、结合缓冲液：20mMsodiumphosphate。pH7.0定容至1000ml称取7.6024gNa3PO4·2H2O（MW380.12），定容置1000ml，调pH至7.0.2、洗脱缓冲液：0.1MGlycine-HCl，pH2.71000ml称取7.507gGlycin

8、e（MW75.07），定容至1000ml，调pH至2.7.【样品准备】样品最好用结合缓冲液稀释，上柱前样品过滤（0.22μm滤膜）或离心。【操作步骤】1、在收集管中加入100μl的1MTris-HCl（pH9.0），用于收集1ml的洗脱液。2、将注射器或泵管充满结合缓冲液。移去柱子上接口的塞子，用适配的接头子将其连接到注射器或者泵管，一“滴对滴“的方式充满柱子后方可以连接