RT-PCR反转录原理及方法.ppt

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1、RT-PCR原理及方法09-10-15背景基因的表达基因组DNA(genomicDNA)信使RNA(messengerRNA,mRNA)蛋白质产物不同细胞或组织表达不同的基因目的通过反转录(reversetranscription，RT)和聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)的方法，检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度。原理及方法mRNA(messengerRNA)cDNA(complementaryDNA)PCR产物RT(反转录)PCR(聚合酶链反应)原理及方法步骤1--提取总RNATRIzol法抽提总RNA1

2、、细胞1×107或组织100mg,加1mlTRIzol(细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底，后转至EP管）颠倒混匀10下，室温5分钟。2、氯仿1/5体积（0.2ml），颠倒混匀10下，室温5分钟。3、4℃，离心12000g，15分钟。4、转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中，加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟。5、4℃，离心12000g，10分钟。6、弃上清，加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml。7、4℃离心7500g，5分钟。8、弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥），溶于DEPC水中至20μl（可

3、在55-60℃水中，<10分钟助溶）。9、紫外分光光度计测总RNA浓度。步骤2—反转录(RT)逆转录反应：1、试剂浓度体积终浓度RNA23μl(11.5μl)Oligo(dT)150.05μg/μl4μl(2μl)0.005μg/μl混匀，离心，70℃5min。2、立即冰水浴，稍离心试剂浓度体积终浓度M-MLVBuffer5×8μl(4μl)1×dNTP10mM2μl(1μl)0.5mMRNasin40U/μl1μl(0.5μl)20μM-MLV200U/μl2μl(1μl)200U总体积40μl（20μl）混匀，离心，42℃60-90min。3、95℃

4、10min（破坏MLV），4℃保存。步骤3—聚合酶链反应(PCR)PCR反应：反应体系：总体积20μl(50μl)试剂浓度体积终浓度TaqBuffer10×2μl(5μl_)1×dNTP10mM0.2μl(0.5μl)<200uM上游引物10pmol/μl0.3μl(1μl)10pmol下游引物10pmol/μl0.3μl(1μl)10pmolcDNA模板(1-10μl)Taq酶2.5U/μl0.3μl(1μl)2.5U/μlDEPC水20μl-4.3μl混匀反应条件：95℃5分预变性94℃30秒变性X℃40秒退火72℃30秒延伸72℃7分终末延伸28-3

5、6循环，4℃保温步骤4—琼脂糖凝胶电泳加1-10μlPCR产物与上样缓冲液（1-2.5μl）混匀，加样，电泳。所需材料及试剂一、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1ml、200μl、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml

6、、1.5ml、20μl10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大所需材料及试剂二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再高压）

7、3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高温干烤所需材料及试剂三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖所需材料及试剂四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris54g硼酸27.5g0.5MEDTA20ml？pH8.0蒸溜水1000ml5×TBE（贮存液）再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取5

8、0ml贮存