转录组测序技术原理及应用.ppt

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1、RNA测序技术原理及应用遗传的中心法则基因组—转录组—表观遗传组—蛋白组层次什么是转录组？AlltranscriptsAllmRNAsRNA是解读基因组的关键RNAProteinPhenotypeGenotypeDNA测序技术RNA-SeqSmallRNA测序降解组测序Non-codingRNA测序研究对象mRNASmallRNAmRNANon-codingRNA鉴定新分子OOOO表达谱研究OOOO基因结构分析O/XXXOEST测序O/XXXX筛选分子标记OOOX转录融合基因表达O/XXXXRNA测序技术WorkflowofRNA-Seq样

2、品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析TotalRNA样品检测Agilent2200检测OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7新型安捷伦2200TapeStation系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解决方案。●可扩展的通量—16联或96孔微量滴定板●快速得到结果—平均每个样品只需一分钟便可获得结果●使用简单—可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程

3、●样品用量少—每次运行仅需要不到2ul样品检测报告-合格样品棉铃虫/果蝇检测报告-不合格样品WorkflowofRNA-Seq样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析真核mRNA的纯化mRNA的纯化主要通过的磁珠与生物素吸附原理从而分离纯化Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要是mRNA的3′的polyA与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合。磁珠通过MPC（磁分离器）从溶液中分离出来。mRNA与磁珠结合后，再用Tris-HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中。链霉亲合素包被磁珠+生物素

4、标记Oligo（dT）25+poly（A）原核mRNA的纯化AmbionMICROExpressKitLNA扣锁型探针mRNA反转录---fragment+RT纯化过的mRNA样品加入1µl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1µl的stopbuffer终止反应。加入沉淀剂（NaAc糖原无水乙醇）沉淀产物。RTdscDNA末端修复(防止自连）cDNA3′末端加AAdapter连接第一天消化DNAmRNA的分离mRNA的打断cDNA的合成↓↓第二天末端修复↓↓加接头胶回收3’端加A第三天PCRPCR胶回收↓↓文库制备↓↓文库

5、质量检测：Aligent2100：片段大小、纯度、浓度qPCR：片段大小、浓度手工检测：跑胶验证。WorkflowofRNA-Seq样品检测文库制备ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析ApplicationRNA-Seq(单端测序---Quantification)RNA-Seq(双端测序---Transcriptome)Expression-profiling√√AlternativeSplicing－√FusionGene－√SNPdetection－√HiSeq2500ApplicationsofR

6、NA-Seq17RNA-Seq(Transcriptome)WorkflowofRNA-Seq(Transcriptome)生物信息学分析RNA-Seq(Transcriptome)CharacterizethetranscriptomeinunparalleleddetailTechnique220RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)文库构建测序组装Denovoasse

7、mbleatranscriptome组装流程数据产出统计及测序数据的成分和质量评估组装结果分析（Contig长度分布、Scaffold长度分布、Unigene长度分布）Unigene（transcript）功能注释Unigene的GO分类Unigene代谢通路分析预测编码蛋白框（CDS）Unigene表达差异分析（两个或两个以上样品）Unigene在样品间的差异GO分类（需两个或两个以上样品）和Pathway富集性分析Denovoassemblytranscriptome信息分析主要内容：Denovoassemblytranscriptome信

8、息分析流程Unigenes的GO注释Pathway分析RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)cDNA文库构建测序比对到参