重组DNA技术精简版课件.ppt

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1、基因重组与基因工程Generecombinationandgeneticengineering孙庆涛刘华明2011.3.16重组DNA技术又称为基因工程（geneticengineering）或分子克隆（molecularcloning）。基因工程的操作过程主要由以下步骤组成：①载体和目的基因的分离②载体和目的基因的切断③载体和目的基因的重组④重组DNA的转化和扩增⑤重组DNA的筛选和鉴定一、载体和目的基因的分离为了进行基因重组，首先需要对载体DNA和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯品。（一）载体：基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid

2、)噬菌体(phage)病毒(virus)这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切点。2．噬菌体：可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可

3、进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。3．病毒：常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。（二）目的基因：目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行：1．直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。2．人工合成：根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。3.从mRNA合成cDNA：采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，

4、再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。4．从基因文库中筛选：将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G-文库(genomicDNAlibrary)。将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNAlibrary)。C-文库具有组织细胞特异性。5．利用PCR合成：如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）技术，在体外合

5、成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。PCR概述PCR：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用DNA合成酶和四种脱氧核糖核酸进行DNA的体外合成反应。PCR技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获得多达几百万拷贝的目的基因。该技术在上个世纪80年代中期由美国K.Mullis发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，K.Mullis也因此获得1993年度的诺贝尔化学奖。PCR基本原理DNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是DNA聚合酶、DNA连接酶、引发酶、DN

6、A引物、四种脱氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。PCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的DNA复制，所以在一个PCR中必需成分是1.模板DNA2.DNA聚合酶3.四种脱氧核糖核酸4.正向和反向两条引物5.适当的缓冲体系。变性：是指模板的热变性，双螺旋模版DNA成为单链的DNA分子；在应用TaqDNA聚合酶进行PCR反应时，变性往往在94℃～95℃条件下进行。这也是TaqDNA聚合酶进行30个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低

7、5～10℃，PCR实验要对退火温度进行优化。PCR基本步骤延伸：在镁离子存在条件下，DNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加在引物的3′端，使引物沿5′→3′方向生成与模版DNA互补的新DNA链。双链模版DNA变性退火5′3′5′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′上游引物下游引物延伸3′5′5′3′3′5′5′3′多次循环（2n拷贝）1、目的基因的克隆2、基因的体外突变3、DNA和RNA的微量分析4、DNA序列测定5、基因突变分析PCR的主要用途二、载体和目的基因的切断通常采用限制性核酸内切酶(restrictionendonuclea

8、se)，简