液相色谱分析法课件.ppt

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1、第十一章　高效液相色谱法（Highperformanceliquidchromatography，HPLC）第一讲概述第三讲高效液相色谱方法简介（原理）第二讲高效液相色谱仪第四讲高效液相色谱法的应用色谱分离方式的选择本章导学：学习要求学习方法建议学习要求掌握液相色谱法的基本原理，了解液相色谱仪的构造，液相色谱法的分类。掌握液相色谱分析方法的选择以及定性定量分析方法；了解HPLC的应用。学习方法建议1.通过文献查阅，理解方法的应用及与理论的结合点。2.采用对比的方式进行GC与HPLC异同点对照，有助于对两种色谱方法的理解。3.从仪器结构

2、上讲搞清楚“高效“的含义。4.对于高效液相色谱的类型，重点在液—固色谱法和化学键合相色谱法的固定相、流动相的特点及其选择。第一讲概述一高效液相色谱技术的出现二、高效HPLC与经典LC方法的比较四、液相色谱分离原理及分类三、HPLC与GC的比较液相色谱是以溶剂液体为流动相的色谱方法。早期，是在直径1～5cm,长50～500cm的玻璃柱中进行的。即使这样，流速仍然很低(＜1mL/min)，分析时间仍然很长！当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，人

3、们认识到：最为有效地增加柱效的方法是减小填充物的粒径（3~10m）！直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。为保证柱流速，固定相颗粒直径多在150～200m范围内。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。一高效液相色谱技术的出现高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；经典方法靠重力加料，速度慢需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测

4、器灵敏度极高：UV－10-9g,荧光检测器－10-11g。HPLC具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点,所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。（最高输送压力可达4.9107Pa）(每米塔板数可达几万或几十万)二、高效HPLC与经典LC方法的比较流动相的选择：GC：有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC：采用的流动相为液体或各种液体的混合，除了起运载作用外，可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。分析对象及范围：GC：只限于气体和低沸点的稳

5、定化合物（占有机物总数的20%）HPLC：可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物（占80%）操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。基本理论：LC的塔板理论、速率方程与GC基本一致；基本概念：LC的术语（如保留值等）、定量、定性方法与GC一致。相同点不同点三、HPLC与GC的比较根据分离机制不同HPLC分离的实质根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。样品分子与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。液固吸附色谱化合键合色谱离子交换

6、色谱分子排阻色谱亲和色谱HPLC的分类四、液相色谱分离原理及分类第二讲高效液相色谱仪岛津HPLC结构组成一、高压输液系统二、进样系统三、分离系统四、检测器记录系统结构示意图高压泵将储液器中的流动相经过进样器输入色谱柱，待分离试样由进样器注入，随流动相一起进入色谱柱分离，被分离组分依次进入检测器，检测信号由记录仪记录或经过数据处理得到色谱图。He储液瓶分布器过滤2m高压泵入口检查出口检查脉流消除抽气过滤器反压调节压力计注样阀分离柱检测器储液器HPLC仪器详解一、高压输液系统贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约

7、2m，可防止颗粒物进行泵内。脱气：超声波脱气或真空加热脱气。高压输液泵：由贮液器、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。梯度洗脱装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。低压梯度：如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；高压梯度：如有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。梯度洗脱方式：低压梯度（外梯度）、高压梯度（内梯度）二、进样系统与GC相比，

8、HPLC柱要短得多，因此，由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。对进样器的要求：密封性好、死体积小、重复性好、对系统的压力和流量波动