基因工程的原理和技术课件.ppt

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1、回顾1、基因工程操作工具有哪些？各有什么作用？2、什么是基因工程?其大致过程如何?第二节基因工程的原理和技术一、基因工程的基本原理让人们感兴趣的基因(目的基因)在宿主细胞中稳定和高效表达.思考：怎样能够在大肠杆菌中生产人的胰岛素？剪切拼接导入表达（一）获得目的基因（二）形成重组DNA分子（三）将重组DNA分子导入受体细胞（四）目的基因的检测和鉴定二、基因工程的基本操作步骤1、筛选含有目的基因的受体细胞2、目的基因的表达（如人胰岛素基因）（胰岛素基因与载体结合）（如大肠杆菌）（有胰岛素基因的大肠杆菌）（生产胰岛素）步骤一获得目的基因化学方法合成（D

2、NA合成仪）利用PCR技术扩增已知序列：从基因文库获得未知序列：(DNAlibrary)聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)从基因文库中获取目的基因1.基因组文库将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。2.部分基因文库受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。核酸酶H与载体连接导入受体菌群DNA聚合酶用适当限制酶切割与载体连接导入受体菌

3、群基因文库的构建（1）基因组文库的构建提取某生物全部DNA许多DNA片段该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成mRNA逆转录酶杂交双链单链DNA双链DNA该生物cDNA文库基因组文库和部分基因文库基因组文库部分基因文库蛋白质氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列推测结构基因的核苷酸序列化学合成目的基因用化学方法合成目的基因即：根据已知氨基酸序列直接合成DNADNA合成仪利用PCR技术扩增目的基因聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。过程高温变性

4、（90~95℃）低温退火（55~60℃）适温延伸（70~75℃）双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。多次重复特点：指数形式扩增步骤二形成重组DNA分子质粒胰岛素基因限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端步骤二形成重组DNA分子用相同的限制性内切酶分别切割目的基因和载体DNA（如质粒），形成相同的黏性末端，再用DNA连接酶连接，形成重组DNA（如重组质粒）步骤三将重组DNA分子导入受体细胞1.基因工程中常用的受体细胞有哪些？P8页常用受体细胞大肠杆菌枯草杆菌酵

5、母菌动植物细胞——常用载体——质粒、噬菌体——质粒——动植物病毒思考；为什么常用细菌和酵母菌作受体细胞？将目的基因导入受体细胞（微生物细胞）受体细胞：细菌CaCl2细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞目的基因随受体细胞的繁殖而复制2.导入过程如何？将目的基因导入受体细胞（植物细胞）农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法将目的基因导入受体细胞（动物细胞）显微注射法步骤四目的基因的检测与鉴定即：筛选含有目的基因的受体细胞目的基因的表达目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。主要是从分子水

6、平进行检测、从个体水平进行鉴定。可以根据质粒上的标记基因用选择性培养基来筛选，是个体水平的筛选。见P7页用同位素标记的目的基因片段杂交适当限制酶切割分子水平的检测提取受体生物全部DNADNA片段显出杂交带分子杂交技术1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因（表明目的基因已插入）用同位素标记的目的基因片段杂交2.检测目的基因是否转录出了mRNA提取受体生物的mRNA显出杂交带（表明目的基因已转录出了mRNA）检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。与相应抗体杂交3.检测目的基因是否翻译出蛋白质抗原

7、—抗体杂交技术提取受体生物的蛋白质显出杂交带（表明目的基因已形成蛋白质产品）个体水平的鉴定例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。