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1、蛋白质互作Protein-proteininteraction1.蛋白质互作研究的意义2.蛋白质互作（事例）3.细胞内蛋白质标记4.其他进展References：BruceAlbertsetal,MolecularBiologyoftheCell(5thedition),GarlandScienceEricaGolemisetal,Protein-proteinInteraction—AMolecularCloningManualpapers1.蛋白质互作研究的意义(Importance)生命活动细胞活动:基因是关键基因表达调控与其它分
2、子结合:信号转导转录蛋白质:修饰翻译蛋白作用单个蛋白:较少蛋白复合体动态蛋白质相互作用:结构,最具挑战性分子水平：基因组DNA：基因重排，Ig多样性基因序列多样性（Science.2004，305:251-254），抵抗不同病原（低等动物）等作用DNA修饰，甲基化（epigenomics），S修饰等mRNA：启动子，ChIP，EMSA非编码小RNA（siRNA，miRNA，piRNA）（epigenomics）蛋白质：蛋白质互作（蛋白质组学）蛋白质结构（工具，生物信息学）蛋白质标记（细胞固定，活细胞标记）异构体2.蛋白质互作（prote
3、in-proteininteraction）事例病毒-对虾蛋白互作经济模式动物Whitespotsyndromevirus(WSSV)对虾:无脊椎动物，仅有先天性免疫系统,无特异性免疫体表阻挡细胞系统：吞噬细胞、细胞凋亡体液防御系统：干扰素、抗病毒肽、凝集素等无脊椎动物免疫系统1)概述开始研究前，必须了解研究背景（1）模式识别：模式识别因子（2）信号转导：受体藕联蛋白信号转导（3）抗病毒效应：干扰素,抗病毒肽,细胞凋亡,细胞吞噬。蛋白质互作非特异性免疫特异性免疫Nature2005,434:27蛋白质互作如何开始研究?抗病对虾：mRNA
4、差异显示技术（DD-PCR），抑制差减杂交，亲和层析36842751970个对虾抗病相关基因，其中30个新基因2)对虾抗病毒相关功能基因筛选Rab6:抗病毒对虾中上调表达说明在抗病毒免疫反应中起作用重要的小G蛋白小G蛋白:GTPase,20-25kDa5个家族Ras:细胞生长调节Rho:actin细胞骨架重组,基因表达调控Rab:膜性颗粒的锚定与融合Arf:调节膜性颗粒的运输Ran:调控核内运输胞质细胞核Rab蛋白在体内以两种构象形式存在，活化的Rab蛋白为GTP结合形式，位于胞膜；未活化的Rab蛋白与GDP结合，位于胞浆。Cell,2
5、007,129:865ThierryGalvezetal.2012.Cell151:234Rab蛋白:所有的真核生物中都有Rab蛋白酵母中的Rab蛋白称为Ypt蛋白,7个Rab蛋白线虫(Celegans)29种Rab蛋白果蝇(Drosophilamelanogaster)26种Rab蛋白拟南芥(Arabidopsisthaliana)57种Rab蛋白人有60多种Rab蛋白PM1-3，G1-3:与GTP结合/分解相关的保守区,G结构域F1-5:Rab的保守区高度可变的N端和C端G结构域:6个β折叠(β1-β6),5个α螺旋(α1-α5)和
6、5个多肽环。多肽环:β折叠与α螺旋之间由多肽环连接氨基酸序列高度保守Mg2+和鸟嘌呤的结合位点，同时催化GTP水解开关I和开关II:Rab蛋白与它的GEF和GAP的关键位点Rab6在抗病毒对虾中上调表达参与抗病毒免疫反应参与免疫的途径?筛选与Rab6结合的蛋白质蛋白互作GSTpull-down,CoIP,酵母(细菌)双杂交,噬菌体展示,蛋白质芯片,Native/SDS-PAGE蛋白质鉴定蛋白互作验证功能3)互作蛋白筛选GST“X”“Y”GST(Glutathione-S-transferase)pull-downassaySepharo
7、seGSH
8、BamH1
9、
10、EcoR1
11、
12、SmaI
13、SalI
14、XhoI
15、NotI
16、...ATCGAAGGTCGTGGGATCCCCAGGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGC......TAGCTTCCAGCACCCTAGGGGTCCTTAAGGGCCCAGCTGAGCTCGCCGGCG......IleGluGlyArgGlyIleProArgAsnSerArgValAspSerSerGlyArg...
17、FactorXa
18、HistagSDS-PAGEWesternblotCo-Immunoprecipitation(Co
19、IP)不受互作蛋白结合位点影响蛋白条带较多nucleushis-leu-trp-Yeast2-HybridAssayMeasurableproductDBDbaittrpADfishleureporterD
