基因工程的操作复习.ppt

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1、基因工程的操作1、掌握基因操作的工具2、掌握基因操作的基本步骤3、了解获取目的基因的方法，掌握PCR技术与细胞内DNA分子复制的异同4、掌握基因操作的工具在构建基因表达载体过程中的重要意义5、掌握农杆菌转化法的过程，了解其它转基因的方法6、掌握目的基因检测的方法学习目标基因工程的操作步骤目的基因的检测与鉴定获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞第一步：获取目的基因从基因文库中获取目的基因基因文库包括基因组文库和cDNA文库工具：限制酶，DNA连接酶人工合成目的基因条件是：基因比较小，且核苷酸序列已知方法：1、从蛋白质合成2、反转录法3、PCR法第二步：基因表达载体的构建：它们所

2、处的位置和有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA聚合酶结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞标记基因第三步：将目的基因导入受体细胞（又称为转化）将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞检测①导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法——DNA分子杂交②表达检测转录检测——分子杂交翻译检测——抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定关于限制酶的问题一般来说，不同的限制酶有不同的识别序列，有不同的切点位置，切出不同的黏性末端，但也有两种特殊情况：1.

3、不同的限制酶有不同的识别序列，但可以切出相同的黏性末端，如以下两种酶处理得到黏性末端均为AATT：酶I识别序列GAATTCCTTAAG酶IIAAAATTTTTTTTAAAA两种酶经常用于同一个基因工程中限制酶的选择使用例题：基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图示判断下列操作正确的是A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割限制酶的选择使用变式训练

4、1抗四环素基因EcoBBamHⅠHinDⅢBamHⅠ应选择哪种限制酶？HinDⅢ限制酶的选择使用变式训练2抗四环素基因EcoBHinDⅢBamHⅠ使用的限制酶EcoBBamHⅠHinDⅢ含四环素的培养基上的生长情况含青霉素的培养基上的生长情况抗青霉素基因×√√×√√关于限制酶的问题2.不同的限制酶有相同的识别序列，但可以切出不同的黏性末端，如：酶I识别序列GGAATTCCCCTTAAGG酶IIGGAATTCCCCTTAAGG黏性末端GAATTCAATT这两种酶不会在同一个基因工程中采用1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力

5、Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞整合植物细胞染色体DNA表达新性状转入农杆菌整合到染色体上转移至受体细胞（2）基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。常用于单子叶植物的转化方法（2）基因枪法——微弹轰击法特点：成本高适用于单子叶植物胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（3）花粉通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（

6、含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得2、将目的基因导入动物细胞方法:显微注射技术操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫早期胚胎新性状动物2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取受精卵显微注射受精卵新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA植物基因工程动物基因工程微生物基因工程常用方法受体细胞比较目的基因导入不同细胞的方法农

7、杆菌转化法显微注射法Ca2+处理法体细胞受精卵原核细胞（一）、检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤)①.首先取出转基因生物的基因组DNA（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（二）、鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目