《DNA重组技术的基本工具》讲稿.ppt

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1、一、基因工程的概念：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。原理操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因重组生物体外基因/DNA分子水平剪切→拼接→导入→表达人类需要的基因产物1.限制酶和DNA连接酶的作用分别是什么?限制酶的作用是能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开DNA连接酶的作用是连接被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键问题探讨：问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种

2、可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？普通棉花　　抗虫棉2.为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植物和动物中没有?提示：从噬菌体侵染细菌中获得灵感原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是生物在长期的进化过程中形成了完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制性核酸内切酶就是细菌的防御性工具，当外源DNA侵入时，限制性核酸内切酶会将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制性核酸内切酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而保护自身的作用。AA

3、TTGCCTTAAG磷酸二酯键磷酸二酯键如何切割DNA分子呢？DNA分子磷酸二酯键切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”一、限制性核酸内切酶——“分子手术刀”1、来源——主要是从原核生物中分离纯化而来（流感嗜血杆菌）2、功能——一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。限制酶的识别序列：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的EcoRⅠ黏性末端黏性末端GobackEcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback重复演示什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链

4、的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。SmaⅠ平末端　　　平末端要想获得目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。要把目的基因插入运载体的前提是什么必须用同一种限制酶来切割目的基因和运载体。思考?模型构建1CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG练习使用EcoRI剪切目的基因CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG目的基因黏性末

5、端二、“分子缝合针”——DNA连接酶①作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.②作用原理：催化磷酸二酯键形成可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶　　　　　　　　或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶模型构建2使用DNA连接酶制作重组DNA分子甲片段CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATT乙片段GGCATCTTAAAATTCCGTAG重组DNA分子Recombinant

6、DNAGGCATCTTAAAATTCCGTAG③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别（二）“分子缝合针”——DNA连接酶2．DNA连接酶(1)常用的DNA连接酶.DNA聚合酶与DNA连接酶是同一种酶的不同名称吗?相同区别DNA聚合酶形成磷酸二酯键只能将单个核苷酸连接到核酸片段上;以一条DNA链为模板,形成互补的DNA链。DNA连接酶将两个DNA片段之是形成磷酸二脂键；将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板。问题:DNA复制时需要哪

7、些酶?三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体⒈载体需要的条件：⑴有1~多个限制酶切点⑵对受体细胞无害⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达⑷有某些标记基因，便于筛选⒉常用运载体：⑴细菌的质粒⑵噬菌体或某些动植物病毒⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？2、作用将外源DNA携带进受体细胞后，停留在细胞中进行自我复制或整合到染色体上，随染色体DNA进行同步复制。质粒DN

8、A分子上有特殊的遗传标记基因，如抗四环素、氨苄青霉素等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。3、