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1、转录组测序结题报告1．mRNA纯化：抽提得到的总RNA首先利用10U的DNaseI（Ambion，美国）在37℃消化1小时；然后利用Micropoly(A)PuristTMmRNApurificationkit（Ambion，美国），进行mRNA纯化：把RNA稀释到250μl的体积，按照Kit的操作步骤（Cat.No:1919）进行；最后得到的mRNA用100μl预热的THE缓冲液洗脱，利用NanoDrop进行定量。2．cDNA合成：cDNA合成是在Ng等2005年发表的方法基础上改进而成（文献1，图1）。第一
2、链cDNA合成利用GsuI-oligodT作为反转录引物，10μg的mRNA作为模板，用1000单位的SuperscriptIIreversetranscriptase(Invitrogen，美国)在42℃作用1小时完成；随后利用NaIO4（Sigma，美国）氧化mRNA的5’帽子结构，并连接生物素；通过DynalM280磁珠（Invitrogen，美国）筛选连接了生物素的mRNA/cDNA，并通过碱裂解释放第一链cDNA；然后通过DNAligase（TaKaRa，日本）在第一链cDNA的5’末端加上接头，然后
3、通过ExTaqpolymerase(TaKaRa，日本)合成第二链cDNA。最后通过GsuI酶切去除polyA和5’端接头。图1.全长cDNA合成示意图3．cDNA测序：合成的cDNA利用超声仪（Fisher）打断到300-500bp的范围，利用AmpureTMbeads（Agencourt，美国）进行纯化。随后纯化的cDNA利用TruSeqDNAXXmplePrepKit–SetA(illumina，美国)制备文库，并利用TruSeqPEClusterKit(illumina，美国)进行扩增。最后在illum
4、ina机器上进行测序反应。测序得到的数据统计见表1.表1.Solexa测序统计样品对照12Reads数目(对)5,500,00010,254,84811,160,428Cleandata5,442,81510,160,13010,998,951（98.96%）（99.08%）（98.55%）平均长度1001001005．EST拼装：利用trinity进行拼装。共得到45,308个ESTcluster(contigs)。具体拼装结果见表2和图2。表2.拼装统计样品XXContig数目45,308Contig平均长
5、度698Contig长度范围201-16,169contiglength16000151291400011369120009436100008000670560004000188820007810200-300301-500501-10001001-20002001-3000>3000图2.Contigs长度分布(横坐标为基因长度分布，纵坐标为基因数量分布)6．数据分析：6.1基因预测：采用EMBOSS工具包(参考文献2)中的’GetORF’对拼装得到的contigs进行基因预测，从不同contigs中找到蛋白
6、编码序列。6.2基因注释：将预测得到的蛋白编码序列与GenBank的NR、GO、KEGG、KOG等数据库利用blastp进行比对，条件为Evalue<1e-5，选择匹配最好的一项作为注释信息。详细结果见annotation.xls，由左至右分别为拼接软件产生的contig名称、基因功能注释、ORF起始与终止位点坐标、正反义链、氨基酸长度、KOG分类。6.3GO分析：GO分析利用GoPipe（参考文献3）进行，预测蛋白首先与Swiss-Prot和TrEMBL数据库进行比对，条件为blastp，Evalue<1e-
7、5，然后比对结果利用GoPipe程序，根据gene2go，得到预测蛋白的GO信息。共有4,823个预测蛋白，匹配28,168项GOterms,如图3所示。详细结果见annotation.xls中“GO”sheet栏。cellular_component450040423801400035003049300025002000150011481020100050092725112720molecular_function400036593500304430002500200012521177150093973810
8、0057845450029627025918917416416213210885755246271710210biological_process40003715348735003000250020092000160615009958157801000637517477426370500114847664432995430图3.GO分布6.4代谢通路构建：利用KEGG数据库（参考文献3
