人 白介素8 IL-8 Elisa试剂盒检测方法原理步骤说明书.doc

《人 白介素8 IL-8 Elisa试剂盒检测方法原理步骤说明书.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、人IL-8定量分析酶联免疫检测试剂盒IL-8简介：IL-8是由巨噬细胞产生的单核因子，是趋化因子家族C-X-C亚族（α亚族）中的一员，对中性粒细胞、T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞具有趋化作用，能够吸附中性粒细胞，嗜碱性粒细胞和T细胞，但是单核细胞除外。人的IL-8cDNA序列表明有99个氨基酸残基。经过剪节掉22个个残基后，形成成熟的具有77个氨基酸的蛋白。IL-8还能够调节T淋巴细胞、B淋巴细胞成熟分化，在炎症反应、免疫调节中起重要作用，并且研究表明IL-8还具有促进血管生成的作用。IL-8在人体内存在两种主要形式，一种

2、是来源于单核细胞含72个氨基酸的多肽，另一种是来源于内皮细胞含77个氨基酸的多肽。72aa比77aa的IL-8具有更高的趋化活性，而77aa的IL-8具有诱导白血病细胞凋亡的功能，其位于N端的五肽序列已被确定是IL-8具有诱导凋亡功能的活性部位。检测原理:本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-8的浓度。IL-8捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IL-8会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人IL-8抗体后，抗人IL-8抗体与IL-8接合，形成夹心的免

3、疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在IL-8将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，IL-8浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-8浓度。人定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:组分规格预包被板1

4、2条或6条样本分析缓冲液1瓶5ml/3ml标准品稀释液10ml/5ml标准品2/1（冻干)生物素化抗体1瓶10ml/5mlHRP连接的酶结合物1瓶10ml/5ml浓缩洗涤液20×30ml/瓶TMB底物1瓶10ml/5ml终止液1瓶5ml/3ml封板胶纸3/2张说明书1份标本收集:1.标本的收集请按下列流程进行操作：A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集；D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复

5、冻融。2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除；4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。注：正常人血清或血浆样本请用标本缓冲液做倍比稀释后再检测。注意事项:1.试剂盒请保存在2～8℃。2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。3.若标准品复溶后，请在三天内用完。4.底物请勿接触氧化剂和金属。5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加

6、液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。8.室温反应，请严格控制在25～28℃。9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。11.加样过程中避免气泡的产生。12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。检测前准备工作:1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。3.标准品:加入去离子水0.75ml至冻干标准品瓶中使IL-8终浓度达到2000pg/

7、ml，静置15分钟后轻轻混悬待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为2000pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）洗涤方法:自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。实验过程需自备的材料：1.不同规格的加样枪及相应的枪头；2.酶标仪；3．自动洗板机；4．去离子水或双蒸水；操作步骤:1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔

8、袋密封，保存于4℃。2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育120分钟。对于血清或血浆标本，请加入50ul样本分析缓冲液后加50ul标本，如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加