DB32∕T 2561-2013 鹅坦布苏病毒的检测 RT-PCR 方法.pdf

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1、ICS65.020.99B22备案号：40447-2014DB32江苏省地方标准DB32/T2561-2013鹅坦布苏病毒的检测RT-PCR方法MethodofRT-PCRdetectingGooseTembusuVirus2013-12-20发布2014-01-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2561-2013前言为规范鹅坦布苏病毒分子生物学检测技术，提高鹅坦布苏病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编写。本标准的附录A为规范性附录

2、。本标准的附录B为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：黄欣梅、李银、刘宇卓、赵冬敏、韩凯凯。DB32/T2561-2013鹅坦布苏病毒的检测RT-PCR方法1范围本标准规范了鹅坦布苏病毒分子生物学检测技术RT-PCR的所用引物序列、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。本标准适用于检测鹅脾脏和病毒细胞培养液中鹅坦布苏病毒核酸。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括

3、所有的修订单）适用于本文件。GB16548—2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程NY/T541—2002动物疫病实验室检验采样方法3方法原理聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction），简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR技术以其快速、敏感和特异等优点在动物疫病检测中得到广泛应用，而且随着PCR技术的不断改进，这种针对病原核酸的诊断方法表现出更准确、灵敏和特异的特点。本标准选取了鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5基因保守区域，设计了一对特异性引物

4、，经过了PCR条件的优化、特异性试验、敏感性试验等，对鹅坦布苏病毒的鉴定具有很高的准确性。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备PCR仪，离心机，电泳槽，微量移液器，凝胶成像系统。4.2主要试剂TRIZOL，氯仿，异丙醇，无水乙醇，焦炭酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水，AMV反转录酶，5×AMVBuffer，10mmol/LdNTPs，随机引物，RNA酶抑制剂，25mmol/LMgCl2，10×EXTaqDNA聚合酶Buffer，EXTaqDNA聚合酶，2.5mmol/LdNTP，DNAMarkerDL-2000，琼脂糖。5引物上

5、游引物：5′-GCGGCTCAAGTGGGA-3′；下游引物：5′-CCTCGGTTGTTTGTTTCT-3′。6样品采集按照NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法，病死或扑杀发病鹅，无菌采集脾脏、肝脏、脑、肺脏、肾脏等组织置于－20℃保存，最好用脾脏进行检测。按照GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程，无害化处理病死鹅。1DB32/T2561-20137方法步骤7.1样品处理取病料0.5g～1g按1:10加入DEPC（diethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯）水，置研钵中剪碎并研磨，

6、反复冻融研磨3次，将研磨好的组织以4℃12000r/min离心10min，取上清200µL备用。阴性对照：没有发病的正常鹅脾脏。阳性对照：鹅坦布苏病毒细胞培养物（见附录Ａ）。7.2GTMUVRNA的提取取已处理的待检样品，以GTMUV病毒细胞培养物为阳性对照，以正常脾脏作为阴性对照，无菌水为空白对照，每管依次加入Trizol600µL，振荡混匀后，室温放置10min，加入氯仿200µL，剧烈振荡后，室温放置1min，4℃12000r/min，离心15min，取上层水相750µL，加入500µL异丙醇，混匀，-20℃放置15min，

7、4℃12000r/min，离心10min，去上清，缓缓加入75%乙醇1mL洗涤，4℃8000r/min离心5min，去上清，室温干燥20min，加入DEPC水10µL，使之充分溶解。7.3RT-PCR7.3.1反转录反应5×AMVBuffer4μL，10mmol/LdNTPs2μL，随机引物1μL，RNA酶抑制剂0.5μL，RNA模板10μL，AMV反转录酶1μL，H2O（DEPC处理）1.5μL，总体积为20μL，瞬间离心混匀，65℃反应15min，42℃孵育1h，95℃5min，同时设立阴性、阳性对照，产物于-20℃保存备用。

8、7.3.2PCR的反应按25µL体系进行，含25mmol/LMgCl21.5µL，灭菌水15.75µL，反转录产物2.5µL，10×EXTaqDNA聚合酶Buffer2.5µL，2.5mmol/LdNTP1.5µL，上、下游引物50pmol/µL各