DB32∕T 2258-2012 ‘苏粉13 号’番茄种子纯度SRAP分子标记鉴定方法.pdf

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1、ICS65.020.20B31备案号：37035-2013DB32江苏省地方标准DB32/T2258-2012‘苏粉13号’番茄种子纯度SRAP分子标记鉴定方法RulesforidentificationpurityoftomatosufenNo13usingSRAPmolecularmarkers2012-12-28发布2013-02-28实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2258-2012前言‘苏粉13号’番茄是江苏省农科院蔬菜所最新育成的高抗番茄黄化曲叶病毒病的杂种一代。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准

2、的结构和编写》的规定编写。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：赵丽萍、赵统敏、余文贵、杨玛丽。DB32/T2258-2012‘苏粉13号’番茄种子纯度SRAP分子标记鉴定方法1范围本标准规定了‘苏粉13号’及其亲本的品种纯度SRAP分子标记鉴定方法。本标准适用于‘苏粉13号’及其亲本的品种纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。GB/T3543.2-1995农

3、作物种子检验规程扦样GB/T3543.5-1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB16715.3瓜菜作物种子茄果类3术语、定义和缩略词下列术语和定义适用于本标准。3.1SRAPsequence-relatedamplifiedpolymorphism即相关序列扩增多态性，又叫基于序列扩增多态性，是基于PCR的标记系统。该标记通过17个碱基的正向引物和18个碱基的反向引物对开放读码框(oRFs)进行扩增。3.2品种纯度品种在DNA分子标记条带方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检测样品种子数的百分率表示。3.3引物结合在模板DNA上

4、的互补短链，提供3＇-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补链。3.4内含子真核生物细胞DNA中的间隔序列即为内含子，是存在于真核生物基因中无编码意义而被切除的序列。3.5启动子是一段位于结构基因5＇端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合1DB32/T2258-2012并具有转录起始的特异性。3.6缩略词下列缩略词适用于本标准。SRAP相关序列扩增多态性(sequence-relatedamplifiedpolymorphism)PCR聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction

5、)DNA脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid)TBE三羟基氨基甲烷-硼酸一乙二胺四乙酸二钠（TrisBoric-acidEDTA)4原理SRAP标记均匀分布于番茄基因组中，该标记的正反引物分别是针对序列相对保守的编码区与变异大的内含子、启动子和间隔序列，而由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大，从而扩增出SRAP多态性标记。不同番茄品种由于遗传结构的差异，经过一对或多对引物进行PCR扩增后会形成不同分子量大小的扩增产物，经染色形成不同番茄品种的电泳图谱，鉴定番茄品种纯度。5仪器设备及试剂5.1仪器设备PC

6、R扩增仪；电泳槽；电泳仪；电子天平（感量0.01g，0.001g）；冰箱；微量加样器（10μl，100μl，200μl，1000μl）；恒温水浴锅（0℃-100℃），高速冷冻离心机；磁力搅拌器；高压灭菌锅；数码照相机等。烧杯；容量瓶（500ml，1000ml）；离心管（0.2ml，0.5ml，1.5ml，2ml）；吸头(10μl，200μl，1000μl)；注射器（100ml）；96孔PCR板；离心管架；染色盒等。5.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；氢氧化钠(NaOH)；2+10

7、倍PCR缓冲液（不含Mg）；液氮；三氯甲烷；异戊醇；氯化镁（MgCl2）；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）；TaqDNA聚合酶（5U/μl）；SRAP引物；矿物油；溴酚蓝；蔗糖；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；硼酸；无水乙醇；四甲基乙二胺；过硫酸铵；硫代硫酸钠；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液等。各种试剂配制见附录A。6引物筛选适宜引物应为扩增后的苏粉13号番茄SRAP电泳条带含有双亲条带，而且带型清晰、重复性好。取苏粉13号种子5粒及父母本种子各2粒，利用一系列引物进行分析，从中确定适宜的引物。7方法步骤7.1样品制备从供检样品中随机取苏粉13号番茄种子2

8、00粒，播于穴盘中，待种子长出真叶时，随机选100株取叶片提取DNA。7.2DNA提取取幼嫩叶片放入1.5ml离心管中；加液氮，用事先准备好的枪头进行