DB12∕T 839-2018 茄子种子纯度SSR分子标记鉴定方法.pdf

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1、ICS65.020.20B04DB12天津市地方标准DB12/T839—2018茄子种子纯度SSR分子标记鉴定方法MethodofidentifyingseedpurityofeggplantbyusingSSR-basedmarker2018-11-07发布2018-12-01实施天津市市场和质量监督管理委员会发布DB12/T839—2018刖言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龙江省农业科学院农产品

2、质量安全研究所。本标准主要起草人：兰青阔、王利英、赵新、王成、兰璞、乔军、刘婧、陈锐、关海涛、张耀中、焦贺敏。IDB12/T839—2018茄子种子纯度SSR分子标记鉴定方法1范围本标准规定了茄子种子纯度SSR分子标记鉴定方法的原理、仪器设备及试剂、方法步骤、纯度计算。本标准适用于茄子单交种的纯度鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T6682

3、分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1种子纯度seedpurity种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占鉴定样品种子粒数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。3.2聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR)一种在体外通过酶促反应扩増特异DNA片段的技术。3.3简单重复序列simplesequencerepeat(SSR)由几个核苷酸（1〜6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp(—般为100〜200)的串联重复序

4、列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。3.4分子标记molecularmarker以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，鉴定生物在遗传上的差异。4原理SSR分布于茄子整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR技术将多态的SSR扩増出来，通过电泳检测扩増产物，利用电泳图谱进行茄子种子纯度鉴定。5仪器设备及试剂1DB12/T839—20185.1仪器设备PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000V，400mA，400W);万分之一电子天平；微量加样器；磁力搅拌器

5、；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；pH计等。5.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2)；三羟甲基氨基甲烷（Tris)；盐酸（HCl，36%)；十二烷基硫酸钠（SDS)；氯化钠（NaCl)；氢氧化钠（NaOH)；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED)；过硫酸铵;冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37%)；TaqDNA聚合酶（含Mg2+的10XPCR缓冲液）；四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)；SSR引物；琼脂糖；G

6、oldView染料；定性PCR试剂盒；DNA提取试剂盒；实验用水为重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。5.3溶液配制相关溶液配制方法见附录A6方法步骤6.1取样检测样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定，从中随机取100粒以上种子，取其父母本材料各10份。6.2单粒种子的DNA提取6.2.1样品预处理在玻璃培养皿底部垫上一层厚度约3mm的棉花或滤纸，用水浸湿后均匀地撒上检测样品，再于表面覆盖一层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16h35°C光照培养，8h28°C暗培养，

7、待种子长出子叶后备用。6.2.2DNA提取取单株幼苗子叶，放入1.5mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5mL离心管中。将DNA提取液预热到65°C，每管放入400混合样品，将离心管置于65°C金属浴或水浴锅中，保温30min后取下，向离心管中加入400pL24:1氯仿-异戊醇（V:V)，振荡混匀。10000g离心10min。将上清液200pL转入另一支1.5mL离心管，加入400pL-20°C预冷无水乙醇沉淀DNA。10000g离心1min，弃上清液，加入500pL乙醇——乙酸铵溶液，6000g离心5min收集沉淀。加入100p

8、LTE(pH8.0)溶液溶解DNA。6.2.3DNA的浓度和质量将DNA适当稀释或浓缩，使其OD26。值在0.1〜0.8的区间内，测定并记录其在260nm和280nm的吸光度。以1个OD26。值相当于50mg/LDNA浓度来计算纯化DNA的浓度，并