浓缩胶和分离胶.doc

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1、浓缩胶和分离胶的PH值不同，前者主要表现为浓缩效用，后者表现为电荷效用和分子筛效用。浓缩效应主要在浓缩胶中完成，浓缩胶的pH6.8，在这个pH条件下，缓冲液中的HCl的Cl离子几乎全部解离，Gly的等电点为6.0，仅少数解离为负离子，在电场中移动速度很慢。酸性蛋白质在此pH下解离为负离子，三类离子的迁移速率为Cl>一般蛋白质>Gly，电泳开始后，Cl离子泳动快，在其后留下一个低离子浓度区。Gly在电场中移动很慢，造成移动离子的缺乏，于是快慢离子间就形成了一个缺少离子的高压区，在高压区内所有的负离子都会加速移动，当移到Cl离子区域时，高电压消失，蛋白

2、质的移动速度慢下来，当以上稳定状态建立后，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一个狭小的之间层，并按蛋白质所带负电荷量的多少依次排列成带，浓缩样品，从浓缩胶进入分离胶后，胶的pH升高，Gly的离解度增大，泳动率上升，又因为它分子小，故超过所有的蛋白质分子，紧跟在Cl离子后，Cl离子迁移后，低离子浓度不再存在，形成了恒定的电场强度，因此，蛋白质样品在分离胶中的分离主要取决于它的电荷性质，分子大小和形状，分离胶的孔径有一定大小，对不同相对质量的蛋白质来说，通过时收到的滞阻作用不同，即使静电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。

3、10％和12％胶的差别：根据你目的蛋白分子量而定，如果说是分子量较大的蛋白（60KD以上），可以用10％的胶，分子量在60～30KD之间的可以用12％的胶，低于30KD的我一般都是用15％的胶了。主要在于指示线刚好跑出胶底的时候，你的目的蛋白能够恰好处于胶的中间部分。凝胶的浓度大小不同所对应的凝胶孔径大小也不同，浓度小的孔径大，浓度大的孔径小，一般分离胶用12%的，浓缩胶用5%的，因为浓缩胶的目的就是将所有的蛋白浓缩在同一起跑线上，然后一块进入分离胶分离。据蛋白大小定。WesternBlot转膜在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。膜

4、的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2umforMW<20kDa)。A半干法即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。1实验条件的选择电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓

5、度选择转移时间具体可以根据实际适当调整。目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度转移时间80---1408%1.5-2.025---8010%1.515—4012%0.75<2015%0.52实验操作（1）滤纸和膜的准备(在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。A.检查是否有足够的transferbuffer，没有立即配制。B.检查是否有合适大小的滤纸和膜。C.将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transferbuffer中。D.将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transferbuffer中。PDVF膜在进转移缓冲液时，要在甲醇里面泡多长时间?PVDF是

6、疏水性的，在转膜缓冲液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润。PVDF的预处理是用甲醇浸泡活化，浸泡透之后转入蒸馏水洗两次。用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合。一般5-20分钟都有人在用。可在取胶的同时泡，估计前后5分钟左右。效果还不错。以前有站友发贴，说处理时间没多大关系，关键看膜的质量．确实是这样的。只要让膜完全浸透应该就没问题了。Hybond的PVDF说明书这样的写的：“pre-wetthemembranein100%methanol(10seconds)”。我的理解是，至少10秒钟，多泡下也没关系的

7、，事实上，泡10秒的做过，10分钟的也做过，都没有问题的。（2）转移A.在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。B.将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transferbuffer到膜上，保持膜的湿润。C.将胶剥出，去掉stackgel，小心的移到膜上。D.剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。E.将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。倒上些transferbuffer，再铺两张靠胶滤纸。F.装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。G.转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。3注意事项及常遇到的问题：1）滤纸、胶、膜之间的大

8、小，一般是滤纸>=膜>=胶。2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全