聚合酶链式反应PCR实验报告.doc

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1、实验二聚合酶链式反应（PCR）一、实验原理聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DNA起始，可产生ug量的PCR产物。二、器材与试剂1.器材：移液器，EP管，热盖PCR仪，电泳仪，量筒，锥形瓶，微波炉，电子天平，紫外照色仪2.试剂：引物，模板，TaqDNA聚合酶，原料（dNTPs），缓冲液与Mg2+，H

2、2O,2*PCRmix溶液，DNA染料三、实验步骤PCR反应体系的建立取离心管，依次加入试剂混匀1．H2O12μl2．模板1μl3．引物T71μl4．引物sp61μl5．2*PCRmix15μlPCR仪的热循环反应把离心管放入PCR仪中，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降

3、至56℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3.引物的延伸：经加热至72℃左右DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复该循环30次，每次需要2-3分钟。电泳检测结果扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中，电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射，电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示加入的为1号样，出现在500bp左右条带，而预算结果为扩增出492bp条带，故实验成功。四、讨论1.Mg2+离

4、子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。2.变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。3.EB：溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖中的DNA，可与DNA结合，用标准302nm紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号。4.溴酚蓝：电泳指示剂，相当于300bp的DNA的电泳速度。5.100bpDNAMarkerⅠ

5、是由单独的PCR扩增产物混合而成，已含有1xLoadingBuffer,可以直接电泳。包括11条双链DNA片断：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp和1500bp。特异性加强500bp。每次上样4～5μL。6.模板一般采用50ng-1ug或102--105拷贝，浓度过高反而会抑制反应的进行。7.引物的与模板的互补程度决定了PCR的特异性，常用0.1—0.5uM，浓度过高则特异性下降，会形成引物二聚体影响试验结果。五、结果及结论：

6、经电泳检测到PCR扩增产物中出现500bp左右条带，PCR扩增成功。