人类性染色质小体的制备与观察.ppt

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1、实验六人类性染色质小体的制备与观察一、实验目的掌握观察与鉴别X染色质的简易方法，识别其形态特征及所在部位；鉴定个体的性别，为进一步研究人类染色体畸变与疾病的关系提供基础方法、为遗传病临床诊断提供参考。1、发现1949年，Barr等人在雌猫的神经元细胞核中首次发现一种染色较深的浓缩小体，而在雄猫则没有这种结构。进一步研究发现，其他雌性哺乳动物（包括人类）也同样有这种显示性别差异的结构。而且不仅是神经元细胞，在其他细胞的间期核中也可以见到这一结构。一般认为这种小体是两个X染色体中的一个在间期发生异固缩形成的，故而将其称为X

2、小体，X染色质，Barr小体（巴氏小体）或性染色质小体。Barr小体出现在哺乳动物雌性个体细胞的细胞核膜边缘，这主要是因为这条染色体处在失活状态所致，Morishima等利用放射性标记的方法证实了失活状态的性染色体与其他异染色质（heterochromatin）一样，在DNA复制时总落后于其他常染色质，且大多出现在核膜边缘。性染色质的数目是X染色体数减1。故可以根据X小体的有无、数目来鉴定胎儿的性别和性别畸形。二、实验原理表性染色体组成与X小体数目的关系性染色体组成性别X小体的数目XY男0XO女0XX女1XXY男1XX

3、X女2XXXX女32、莱昂假说为什么正常男女之间的X染色质存在差异？女性两个X染色体上的每个基因座的两个等位基因所形成的产物，为什么不比只有一个X染色体半合子男性的相应基因产物多？为什么某一X连锁的突变基因纯合子女性的病情并不比半合子的男性严重？20世纪60年代以来，不少学者曾提出了一些假说来解释这一现象。其中比较著名的假说是由M．F．Lyon于1961年提出的Lyon假说（Lyonhypothesis）：　　1.）正常雌性哺乳动物的体细胞中，两条X染色体中只有一条在遗传上有活性，另一条在遗传上无活性。　　2.）X

4、染色体的失活是随机的。　　3.）失活发生在胚胎发育早期，X染色体一经失活，其后代细胞中该染色体均处于失活状态。　　4.）杂合体雌性在伴性基因的作用上是嵌合体。3、剂量补偿：细胞内的X染色体数目超过两条时，仍只有一条保持活性，其余的都形成异固缩的X染色质。正常男性只有一条X染色体，所以X染色质的数目为0。45，XO性腺发育不全的患者虽然是女性，但是因为只有一条X染色体，所以细胞内无X染色质。一个细胞中所含的X染色质的数目等于X染色体数目减一。剂量补偿：由于雌性细胞中的两个X染色体中的一个发生异固缩（也称为Lyon化现

5、象），失去活性，这样保证了雌雄两性细胞中都只有一条X染色体保持转录活性，使两性X连锁基因产物的量保持在相同水平上。这种效应称为X染色体的剂量补偿。需要指出的是，失活的X染色体上基因并非都失去了活性，有一部分基因仍保持一定活性，因此X染色体数目异常的个体在表型上有别于正常个体，出现多种异常的临床证状。如47，XXY的个体不同于46，XY的个体；47，XXX的个体不同于46，XX的个体，而且X染色体越多时，表型的异常更严重。三、实验用品1.材料口腔粘膜（男、女）、发根细胞（女）。2.器具显微镜、牙签、染色缸、盖玻片、载玻片

6、、擦镜纸、记号笔3.试剂固定液（95%酒精：冰醋酸=3：1，盛在染色缸中）、蒸馏水、70%、95%酒精、无水酒精、45%醋酸、5mol/LHCl、二甲苯、香柏油、卡宝品红染液。四、实验内容1．获取实验材料A.口腔黏膜细胞取一干净的载玻片，用记号笔在即将涂细胞的一面作个标记。先用水将口漱净，尽可能除去口中的杂物。然后用牙签钝头在口腔一侧用力刮取，弃去第一次得到的刮取物，在同一部位继续刮取（这样就可取得深层的表皮细胞），将刮得的细胞涂抹在干净载玻片上，反复几将从，使玻片上的材料尽量厚些。勿令玻片上的材料干燥，迅速将玻片插入

7、装固定液的染色缸中固定30分钟以上。如果让材料在空气中干燥，会使细胞变形。拿刚涂抹的玻片直接插入固定液中，当然会使许多材料丢失，但粘在玻片面性上的细胞足够观察之需。固定后将载玻片在空气中晾干，这样，细胞就可以紧贴在玻片的表面。B.毛囊细胞（Hairfolliclecell）拔取一根毛根比较大的毛发（头发或其他部位，如手臂上的毛发均可；如可能，尽量选用白色或浅颜色的毛发，这样在制片中就可减少色素的干扰）。在一张干净的载玻片中央滴一滴45%的醋酸，将毛根浸渍其中。静置约5分钟，待毛根稍软后用镊子尖或解剖针尖将外层毛囊的组织

8、细胞轻轻刮下（用力太大，则可能将毛发上的色素细胞一起刮下，影响制片效果）。弃去毛干。用解剖针将载玻片上的组织细胞均匀摊平。摊平的材料在空气中晾干。2．染色1)．在晾干的玻片上直接滴上染料，染色10分钟。2)．在95%的酒精中分色1-3分钟。3)．在无水酒精中继续分色两次，每次1分钟。4)．用二甲苯透明两次，每次约3分钟，直接加盖玻