蛋白质的定量分析：BCA法.ppt

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1、蛋白质定量分析：BCA法实验二主要内容一.实验目的二.实验原理三.实验操作四.注意事项五.蛋白质定量分析方法一.实验目的1、学习BCA法测定蛋白质浓度的原理及操作；2、掌握722型分光光度计、移液管的正确使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法计算蛋白质的浓度；3、了解蛋白质含量测定的多种方法。二.实验原理OH-+2BCA螯合物（紫蓝色）562nmA值标准曲线法M待测蛋白质+Cu2+Cu+C待测二.实验原理紫蓝色562nmA待测含量（ug）AM待测BCA法测定蛋白质含量的标准曲线仪器型号:722型分光光度计作图人:徐先林时间:2012年9月11日三.实验操作实验材料1、器材722型分光光度计、恒

2、温水浴箱、移液管、试管2、试剂（1）试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体混合后调pH至11.25。（2）试剂B：4%硫酸铜。（3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2mL，混合。（4）蛋白质标准液：0.3mg/mL的蛋白质标准液。（5）待测样品。管号试剂（mL）空白管12345测定管标准蛋白溶液（0.3mg/ml）—0.10.20.30.40.5—蒸馏水0.50.40.30.20.1——待测样品——————0.5BCA工作液2.02.02.02.02.02.02.0蛋白质含量ug306090120150表1BCA法

3、测定蛋白质含量数据有改动将上述各管混匀后于37°C保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。空白管？1-5号管？？水浴锅1、以牛血清蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。（有兴趣的同学可以学习excel中绘制标准曲线）2、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量M,再计算出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。C=MV——×250实验结果记录管号空白管12345测定管M(ug)0306090120150？吸光值(A)测定三次求平均值四.注意事项1、实验分组，两人一组2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染3、准确量取试剂，正确使用吸量管4、正确操作722型分光光度计，此次由于

4、溶液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、作图人、时间等6、实验原始记录书写规范，三线表一五.蛋白质定量分析方法BCA法二Folin-酚试剂法三紫外线（UV）吸收法四五考马斯亮蓝结合法凯氏定氮法六双缩脲法蛋白质元素组成特点紫外吸收特性呈色反应方法灵敏度时间原理干扰物紫外线吸收法较低快速酪氨酸和色氨酸在280nm的光吸收核苷酸改良凯氏定氮低费时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮双缩脲法低中速肽键和碱性Cu2＋形成紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液某些氨基酸Lowry法高费时双缩脲反应；酚试剂被还原甘氨酸硫醇考马斯亮蓝法高快速G-250与蛋白质结合物在595n

5、m的光吸值强碱性缓冲液TritonX-100;SDSBCA法最高较快肽键和碱性Cu2＋形成紫色络合物不受去污剂、尿素等的影响BCA法广泛用于科研工作，其特点：1、操作简便，快速2、准确灵敏，试剂稳定性好3、经济适用4、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样品中的去污剂、尿素等化学物质的影响思考1、该实验设计及实验操作过程中，有没有可改进的方法，如果有请说出你的想法？2、比较各种蛋白质定量分析方法的优缺点，并思考各种方法的适用条件。下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳预习要点：1、复习蛋白质两性解离。2、预习电泳的基本原理。3、预习实验操作流程及注意事项。谢谢！一、蛋白质的相关理论知识16%蛋白质的

6、平均含氮量样品中蛋白质的含量=样品中氮含量÷16%（或×6.25）凯氏定氮法1、元素组成（主要有C、H、O、N、S）将蛋白质转化为氨，用酸吸收后滴定2、蛋白质的紫外吸收280nm蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸的特征性吸收峰紫外线吸收法共轭双键3、蛋白质的呈色反应双缩脲法Lowry法考马斯亮蓝结合法茚三酮反应氨基酸与茚三酮共热，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，茚三酮被还原，其还原物可与氨结合，再与另一分子的茚三酮缩合成蓝色的化合物，在570nm处有最大吸收。双缩脲反应肽键+CuSO4→紫、红色（540nm）Folin-酚试剂反应（650nm）考马斯亮蓝结合反应（595nm）OH-BCA法BCA分子式BCA试

7、剂盒BCA(bicinchoninicacid,二辛可酸）紫蓝色实验报告每个大组一份完整的实验报告名称组员【实验目的】【实验试剂及仪器】【实验原理】【实验步骤】原始记录【实验结果】【实验讨论】每个小组(2个人)写一份结果和讨论格式如下:组员名称原始记录实验结果讨论