实验三_药物敏感试验和消毒灭菌.ppt

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1、实验三消毒灭菌和药敏试验实验内容和要求1.掌握药敏试验的原理、步骤、结果及意义2.掌握常用的消毒与灭菌技术3.熟悉紫外线杀菌试验的原理4.了解细菌L型的诱导和菌落类型3一、药敏试验在感染性疾病防治中的意义近年来，由于各种抗菌药物的广泛应用，导致耐药菌株的迅速增多。尤其是广谱及超广谱抗生素的普遍使用，造成耐药菌株大量出现，给临床治疗带来极大的困难。同时，由于不合理的使用抗生素，治疗的失败率及不良反应均有增加。因此，药敏试验在感染性疾病的防治方面具有日益重要的实际意义。4二.培养+药敏的目的1、确定导致感染的病原菌的种类，对于不同的病原

2、菌（G-杆菌或G+球菌，条件致病菌或急性传染病病原菌）需要采取不同的治疗措施。2、确定病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床根据病人情况合理用药。由于细菌耐药性的快速增长，单纯依赖经验选用药物经常无效，在更多的时候需要参考药敏实验的结果。3、用于流行病学调查及院内感染的监控，减少耐药菌株的流行。5三、什么情况下需要做培养+药敏？感染原因无法确定。病原菌的耐药性无法确定，经验用药可能失败（尤其是免疫力低下患者、长期使用抗生素者、ICU病房、院内感染患者、接受导管插入或其他创伤性治疗患者。）病人对可用药物过敏，需要检测其他药物的耐药性。病

3、人个体情况要求对某些药物精确用药，需要测定其最低抑菌浓度（MIC）。四、常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测方法介绍其原理：体外测定抗生素药物抑菌或杀菌的能力。可帮助临床对感染性疾病选择最佳用药，还可进行流行病学调查，了解某些致病菌耐药性变异情况。纸片扩散法（Kirby-Bauertest）稀释法（dilutiontest）E试验法（Etest）联合药物敏感试验特殊耐药菌及耐药酶的表型检测耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶检测等五、纸片扩散法（K-B法）原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平

4、板上，纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑制浓度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。方法：菌液制备：挑取孵育16-24h的血平板上数个菌落置于生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准；涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60º，最后

5、沿平板内缘涂抹1周；贴含药纸片：平板在室温下干燥3-5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm；孵育：35ºC16-18h，量取抑菌圈直径。注意事项1纸片应分布均匀，中心距离不小于24mm。2含菌平板必须避免过浓或过稀。3纸片贴完后应在15min内将平板反过来，置于37度温箱中。4纸片一旦接触培养基就不应再挪动位置。5要注意无菌操作。影响药敏结果的因素培养基应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基

6、18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。细菌接种量细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。药物浓度药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。培养时间一般培养温度和时间为37℃，8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2~4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，

7、而得到较大的抑菌圈。结果判读：用刻度尺量取抑菌圈直径，根据CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）标准判读结果；报告：细菌对该抗生素是敏感（susceptible，S）；耐药（resistant，R）；还是中介（intermediate，I）。12六、如何理解MIC值及药敏结果？每种药物均提供定性和定量两种结果。定性：敏感（S）表示该药物对该细菌有抑制或杀灭作用。使用常规剂量可以达到有效的治疗效果。中介（中度敏感，I）表示细菌对该药物治疗的敏感性低于敏感菌株，必须加大剂量以达到更高的

8、血药浓度才能在特定的生理部位获得有效的临床效力；对于使用剂量有严格限制的药物则必须重复测试以确定敏感还是耐药。耐药（R）表示药物常规剂量所达到的药物浓度不能抑制或杀死细菌，即使加大剂量也不能达到治疗效果或者超过了人体的正常耐受水平。定