应用于PCR技术的DNA聚合酶.doc

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1、合肥学院HefeiUniversity基因工程题目:应用于PCR技术的DNA聚合酶系别:专业班级:学号:姓名:指导教师:2015年12月26日应用于PCR技术的DNA聚合酶摘要DNA聚合酶作为聚合酶链式反应(PCR)的重要因素之一，在PCR过程中起着至关重要的作用，在某种意义上甚至可以说，PCR技术就是耐热DNA聚合酶的技术。故综合研究聚合酶并改善其酶学性能，已成为分子生物学工作者关注的热点之一。本文就PCR技术产生至今DNA聚合酶的研究历史及现状进行简要综述。关键词PCR;DNA聚合酶;酶学特性1DNA聚合酶的分类从大肠杆菌DNA

2、聚合酶工被分离和鉴定至今的50年时间里，已有100多个DNA聚合酶相关基因被克隆和测序，它们分别来自于嗜热极端细菌和古细菌。多种天然的和重组的耐热DNA聚合酶也被鉴定和纯化，这些酶大部分是单体酶，在溶液中的分子量一般为80一115KD。人们根据核普酸序列将大肠杆菌酶DNA聚合酶划分为四类，即DNA聚合酶工((FamilyA),DNA聚合酶II(FamilyB),DNA聚合酶III(FamilyC)和其它的(FamilyX)。DNA聚合酶工主要参与DNA损伤的修复，同时在半保留复制中起辅助作用。DNA聚合酶II堤DNA复制的主要酶[4

3、]。与大肠杆菌DNA聚合酶工同源的为A群，该群除酵母线粒体DNA聚合工外，都来自于原核生物，对双脱氧核普酸抑制剂敏感，因此可用于DNA序列分析。包括E.col栖热菌属(Themus)的DNA聚合酶I、芽胞菌属(Bacillus)的DNA聚合酶I、噬菌体T5、以及升DNA聚合酶等。与大肠杆菌DNA聚合酶II同源的为B群，对双脱氧核普酸不敏感甚至可以接受诸如双脱氧一UTP、生物素一dUTP〕或荧光标记的dUTP〕等修饰过的核普酸，因此这类DNA聚合酶可用于聚合酶链式反应制备或标记核普酸。与大肠杆菌。NA聚合酶II洞源的为C群，C群可分为

4、两个亚群，即以蛋白质引导的(protein-prime)和以RNA引导的(RNA-prime)DNA聚合酶。此外真核生物的俘一。NA聚合酶是已知最小的DNA聚合酶，只有335个核普酸残基，与其它DNA聚合酶缺乏同源性，曾单列为X群。目前发现的耐热DNA聚合酶均属于A群或B群。属于A群的都来源于真细菌，如来源于栖热属的Taq(Thermnusaquaticus)、Tth(T.themnophilus)、Tca(T.caldophilus)、Tfl(T.flavus)、Tfi(T.filiformis)以及来源于芽胞菌属的Bst(Bac

5、illusstearothermnophilis);属于B群的耐热DNA聚合酶均来源于古细菌，如来源于高温球菌属的Tli(Theymococcuslitoralis)[5]、焦热球菌属的Pfu(Pyrococcus.furio-sus)和KOD1(Pyrococcussp.、硫叶菌属的Sac(Sulfolobusacidocaldarius)和Sso(S.solfataricus)等，大量来自B群的DNA聚合酶被称为a-likeDNA聚合酶，因为它们都具有一个保守的真核a-DNA聚合酶氨基酸序列，这些DNA聚合酶都已经广泛应用于PC

6、R技术中。2早期应用于PCR技术的DNA聚合酶一Klenow片段1957年A.Kornberg等从大肠杆菌中分离出了一种以。NA为模板催化单核普酸聚合的酶，称之为Kornberg酶，它是由单一多肤组成的球蛋白，相对分子量为103000Kd。活性区域位于Leu516和His920之间，包括三种不同的酶活性，即5’-3’聚合酶活性、5’-3’外切酶活性和3’-5’外切酶活性。与其它种类的DNA聚合酶一样，其催化单核普酸聚合的反应需要引物的存在，并且在37℃时聚合活性最高，催化单核普酸聚合的速率为1000nt/min。Kornberg酶即

7、为DNA聚合酶工。聚合酶工可被枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶裂解成两个活性片段，较大的C端片段称为Klenow片段，它仍具有5’-3’聚合酶和3’-5’核酸外切酶活性，但失去了5’-3’核酸外切酶活性。较小的N端片段只有5’一3’核酸外切酶活性。Klenow片段就是早期应用于PCR的DNA聚合酶。但是KlenowDNA聚合酶的缺点是在37℃下催化。NA的合成，在60℃时很快就失活，故每一轮PCR都需要追加KlenowDNA聚合酶，使PCR过程繁琐而复杂，同时其亲核反应的掺错率也居高不下，正因为上述缺点而限制了该酶在PCR反应中的应用。其后

8、人们也曾将肠DNA聚合酶和肠DNA聚合酶应用于PCR反应，但是终因它们的热稳定性差而没能得到推广应用。3耐热TaqDNA聚合酶的发现和应用Themusaquatics是一种热栖的可在70℃~95℃下生活的水生真细菌。1988年Band