生物检测技术.doc

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1、pH，电荷、大小和形状；介质粘度，电场强度泳动速度不同：与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷以及电场强度有关。非球形分子（线状DNA）还与粒子形状。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，泳动时有电荷效应与分子筛效应。大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。Rf＝谱带迁移距离/前沿指示剂迁移距离；原理：琼脂糖凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。bufferⅠ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液Ⅱ0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液以上溶液4℃保存备用。⑴1g琼脂糖加入100ml1×TAE电泳

2、缓冲液中,加热溶解。（冷到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并摇匀。）⑵用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。⑶充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。⑸打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。⑹将电泳后的凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺将染色后的凝胶置于紫外

3、透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。支持物要求均匀，吸附力和电渗小，机械性能好，便于染色,最好透明，无紫外吸收。有滤纸，醋酸纤维素薄膜，淀粉凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶等。聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处：分离范围不同琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；聚丙烯酰胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。凝胶配置程序不同琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；聚丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。凝胶的厚度不同琼脂糖凝胶最薄只能达到３ｍｍ；聚丙烯酰胺凝胶

4、可以制成０.２ｍｍ，分辨率高。成本不同。琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高安全性不同。琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE）。催化系统常用有两种：过硫酸氨—TEMED化学催化聚合系统此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）称为加速剂，它能以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使过硫酸氨（APS，引发剂）形成自由基。自由引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺交联反应，形成有孔径的聚丙烯酰

5、胺凝胶。核黄素—TEMED光聚合催化系统此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被限量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比。不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用凝胶层的不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带，然后进行分离。凝胶孔径的不连续性：上述3层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度

6、快；当进入小孔胶时，受到阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。电位梯度的不连续性：电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：HCl在任何pH溶液中均易解离出Cl－，在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子。电极缓冲液中，除有Tris外还有甘氨酸，其pI=6.0，在pH8.3的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度低仅有0.1%-1%，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。整体的程度比例常反映出个体的机遇性

7、。变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺酸钠)、巯基乙醇、DTT等。连续密度梯度电泳（PG-PAGE）原理：连续密度梯度电泳使用的是从上至下的一个正的线性梯度凝胶，点在凝胶顶部的样品在电场中向着凝胶浓度逐渐增高的方向即孔径逐渐缩小的方向迁移。随着电泳的继续进行，蛋白质受到孔径的阻力越大。电泳开始时，样品在凝胶中的迁移速度主要受到本身的电荷密度和样品分子的大小的影响。当迁移所受到的阻力大到阻以使样品分子完全停止前进时，那些跑得很慢的低电荷的样品分子将赶上与它大小