体外细胞培养.doc

《体外细胞培养.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、体外细胞培养•体外培养物的生长生物学•细胞系和细胞株•培养物的冷冻与复苏•培养物的污染、检测和排除优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。（一）、体外培养实验室1.准备室2.培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具冇适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。3.缓冲室4.其他实验室（二）、体外培养的设备和器具设备：1.超静工作台，生物安全柜，净化室2.培养箱：温度,湿度，pH值3.倒置显微镜4.水净化装置：去离子水净化

2、装置，石英玻璃蒸憾器，超纯水装置5.冰箱6.离心机7•冷冻保存装置8.高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平培养器具：1.过滤除菌装置：Zeiss滤器，抽滤式玻璃简易型滤器，针头式加压塑料小滤器2.培养器皿：(1)溶液瓶(2)培养瓶(3)培养皿(4)多孔培养板(5)离心管3.移液器4.筛网：金属筛网(不锈钢网、铜网)，尼龙筛网(%1)培养用液?水和平衡盐溶液(balancedsaltsolution,BSS)水：离子交换水，蒸憾水平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖常用BSS:PBS,RingerEarle,D-Hanks,H

3、anks?培养液：1•天然培养液：1)血清：小牛血清，胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)，马血清，2)水解乳蛋白，3)胚胎渗出液2.合成培养液：合成培养基的种类MEM,RPMI1640,McCoy5A,HAMF12等3•无血清培养基:干粉型培养基的配制：1)•制备高质量的去离子水(玻璃三蒸憾水)或超纯水2).加温水至15-30°C之间3)•加干粉入水中，搅拌令之溶解4).加NaHCO35)・加水至最终量6)・必耍时用INHCI或INNaOH调节pH,因滤过吋pH可能受影响7).用0.22um或小于此微孔滤膜滤过消

4、毒?其他用液：消化液等1.消化液：胰蛋白酶、EDTA溶液2.pH调整液：NaHC03溶液、HEPES溶液2.抗生素液:青链霉素常用的生长培养液：基本培养基80-90%血清侈用小牛血清）10-20%抗生素（多用青霉素100单位/毫升和链霉素100微克/毫升一、细胞体外培养的其它条件一）、无污染的气、液相环境：1>02（5%CO2+95%空气，02:21%）2、CO2-pH3、液相环境■渗透压二）、温度三）、生长基质1、多聚赖氨酸：0.05mg/ml2、纤维连接蛋白：lmg/ml3、胶原：1^3mg/ml4、层粘连蛋白：5^10g/m

5、l一、清洗和消毒1.1玻璃器皿的清洗：浸泡一刷洗一酸浸一冲洗浸酸液：强液：63克重銘酸钾，1000毫升浓硫酸，200毫升蒸馆水O次强液：120克重倂酸钾，200毫升浓硫酸，1000毫升蒸惚水。弱液：100克重铮酸钾，100毫升浓硫酸，1000毫升蒸憎水。胶塞清洗：胶塞入水屮浸泡一2%Na0H煮沸10・20分钟一自来水冲1%稀盐酸浸泡30分钟一自来水冲洗和蒸馆水漂洗2-3次，晾干备用1.2塑料器皿的清洗：1.包装：局部包装；全包装2.消毒：紫外线，干热消毒，湿热消毒，滤过消毒，射线消毒，消毒剂的使用%1)、基本流程：1mm3的植块f

6、植块培养原代培养：/动物器官或大组织块一洗去血污一剔除多余成分/组织剪碎〜蛋白酶消化一机械吹打一铜网过滤一离心一细胞悬液f调幣细胞数f分离细胞培养%1)、实验要点：1、常用实验材料的取材:胚胎、组织、人体手术或活检材料2、分散细胞的方法：1).机械解离细胞法：吸管吹打法，过筛法,单细胞分离器2)•蛋白酶学处理法：胰蛋白酶，胶原酶3).螯合剂解离细胞法：EDTA,柠檬酸钠3、接种和培养过程:：1).植块培养：接种与培养：优点：比较简单，保留了在体时细胞间的相互作用，因而在体外培养时，植块内细胞容易存活和生长。优点：解除了植块内部细胞

7、间的组织关系，从而可以反映出单个细胞的生物学特征。可实现对单一细胞类型进行细胞生物学研究。4、讨论和注意事项?相对于植块内的细胞，分离散细胞在体外更难以存活和生长。?对于大多数贴壁依赖型细胞來说，如何尽快让接种的细胞贴壁，是决定培养物生长快慢的关键步骤。可选用生长基质表面；降低浮力。?细胞密度：105个/ml左右，对大多数动物细胞是比较适中的。三）、原代细胞培养的注意事项1＞培养液：培养基的选择，添加剂，培养液的酸碱度，换液。2、培养的空间：通常培养液与液面上空间的体积比以1:10为宜。一、原代培养物需要传代的指标：继代培养1、植

8、块培养;2、分离细胞培养物;3、悬浮细胞培养物二、传代的过程K主要材料：（1）蛋白酶消化液;（2）培养器皿；（3）培养液及平衡盐溶液2、方法:（1）贴壁生长细胞培养物的传代：吸去旧培养液一PBS或D-Hanks洗一酶消化解离细胞一终止消化一吹打培养