基因克隆及常见问题分析.pdf

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1、TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.内容概要DNA克隆技术简介DNA克隆实验流程DNA克隆的要素DNA克隆常见问题与应对策略800免费电话：800-990-6057DNA克隆的目的目的基因的序列测定及筛选增加目的基因的拷贝，降低后续实验的难度研究基因表达其他（如点突变、SNP等）800免费电话：800-990-6057克隆方法（以PCR产物克隆为例）TA克隆—蓝白斑筛选非定向连接克隆，连接效率高，操作简单，易于长期保存。可进行测序后对正确克隆扩大培养。800免费电话：800-990-60

2、57克隆方法（以PCR产物克隆为例）零背景克隆—无需蓝白斑筛选800免费电话：800-990-6057克隆方法（以PCR产物克隆为例）酶切连接克隆800免费电话：800-990-6057内容概要DNA克隆技术简介DNA克隆实验流程DNA克隆的要素DNA克隆常见问题与应对策略800免费电话：800-990-6057克隆实验的流程网上检索引物设计扩增产物与克隆载体PCR扩增纯化连接转化、DNA制备培养感受态E.coli制备生物信息学PCR或重组克隆测序检测质粒提取分析等酶切鉴定筛选800免费电话：800-990-6

3、057DNA克隆的要素•目的DNA片段•连接酶•克隆载体•感受态细胞800免费电话：800-990-6057TIANGEN六种PCR耐热聚合酶高扩增效率高扩增、高保真Long高保真Pfu长片段扩增Taq高扩增、高保真、高特异性高特异性800免费电话：800-990-6057不同DNA聚合酶PCR产物对比DNA聚合酶扩增片段末端适合克隆类型克隆前处理Taq零背景克隆平端化（平端化酶）粘末端HotMasterTaqTA克隆无零背景克隆无Pfu平末端TA克隆加A（加尾酶）TaqPlus粘末端+平末端零背景克隆平端化（平端化酶）L

4、ongTaq粘末端+平末端TA克隆加A（加尾酶）TaqPlatinum粘末端+平末端800免费电话：800-990-6057目的DNA片段纯化纯化原因：多余引物、多余dNTP、多余镁离子等，可能会影响后续连接反应，建议纯化。PCR特异性好（单带）PCR特异性差（多带）超薄/普通/大量DNA产物超薄琼脂糖凝胶DNA回纯化试剂盒收试剂盒寡核苷酸DNA产物纯化普通琼脂糖凝胶DNA回试剂盒收试剂盒N96DNA产物纯化试剂盒大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒通用型DNA产物纯化试通用型琼脂糖凝胶DNA剂盒回收试剂盒800

5、免费电话：800-990-6057DNA纯化常见问题及对策•凝胶回收无产物或者回收率低•回收DNA质量不好800免费电话：800-990-6057DNA纯化常见问题及对策凝胶无回收产物或回收率低1、胶块太大，未全部溶解1）将胶块切小，增加溶胶时间或是溶胶2、起始量少液体积3、电泳缓冲液老化，PH值2）增加回收起始量升高3）使用新配制的缓冲液进行制胶和电泳4、使用去离子水进行洗脱4）最好用试剂盒配备的洗脱液进行洗脱5、洗脱缓冲液用量过少5）根据起始量使用合适体积的洗脱液6、洗脱缓冲液未加在离心柱6）应加在离心柱正中间，并放置

6、1～2分中心钟，再离心800免费电话：800-990-6057DNA纯化常见问题及对策回收DNA质量不好洗脱产物含有乙醇残留洗脱时硅胶膜上有漂洗液残留，会使洗脱产物中含有乙醇，影响下游操作。在洗脱前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5－10分钟，彻底去除漂洗液。800免费电话：800-990-6057DNA克隆的要素•目的DNA片段•连接酶•克隆载体•感受态细胞800免费电话：800-990-6057T4DNA连接酶作用机理催化相邻DNA链的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，需ATP作辅酶。本酶不仅可

7、以催化粘末端/平末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。反应条件4℃/16℃过夜；37℃1-2h800免费电话：800-990-6057DNA克隆的要素•目的DNA片段•连接酶•克隆载体•感受态细胞800免费电话：800-990-6057T载体•Amp抗性•19个酶切位点•多种试剂盒满足您的实验需求800免费电话：800-990-6057零背景载体•携带致死基因（无需抗性筛选）•13个酶切位点800免费电话：800-990-6057零背景载体—特点•零背景：使用携带致死限制酶基因，无

8、需蓝白斑筛选•高效：高效连接酶，阳性率>95%•通用：适合平末端/粘末端PCR产物•快速：室温连接5分钟（平末端）/10分钟（粘末端）•耐受力强：可插入6bp-10kb的片段800免费电话：800-990-6057零背景载体—实验例800免费电话：800-990-6057零背景载体—平末端连接混匀内容物