实验一 鸡新城疫疫苗(一).ppt

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时间:2020-06-13

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1、实验一鸡新城疫油乳剂灭活苗的制备技术(一)新城疫病毒可以在鸡胚中大量增殖,收获的鸡胚尿囊液中即含有新城疫活病毒,将收获的尿囊液经过灭活,并加入佐剂,便制成了新城疫灭活疫苗。目的和要求:1.掌握鸡胚的孵化过程和鸡胚的接种途径、接种方法;2.掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔的增殖过程,掌握接毒和收毒的方法。实验材料:白壳鸡胚、孵化箱、1mL注射器、蛋托、新城疫Ⅳ系弱毒苗、注射用生理盐水、青霉素、链霉素等实验内容:1.鸡胚的选择和孵化:孵育前的鸡胚先用清水以布洗净,再用干布擦干,放入孵卵器内进行孵育(37℃,相对湿度45%~60%),孵育三日后,鸡卵

2、每日翻动1~2次。孵至第4日,用检卵灯观察鸡胚发育情况,未受精卵,只见模糊的卵黄黑影,不见鸡胚的形迹,这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影,比较大一些的可以看见胚动,随后每日观察一次,将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者,即可能是已死或将死的鸡胚,要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前,具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。2.接种材料的制备:将青霉素和链霉素分别注入注射用生理盐水瓶中,使两种抗生素在生理盐水中的含量均达到1000-2000IU(μg)/ml。将注射用生理盐水3-4ml注入一瓶新城疫Ⅳ系弱毒疫苗

3、中,稀释。3.照蛋定位:接种前应在照蛋器下检查鸡胚,挑出死胚和弱胚。对所有健康胚应先用红铅笔画出气室位置,再于胚胎侧画出接种位点(进针点),接种点应避开大血管,靠近气室边缘处,离胚头约1cm左右。4.病料接种:若用鸡胚分离、培养病毒,则应选9~12日龄之间的发育鸡胚。许多病毒,特别是大多数禽病毒都能在鸡胚或鸭胚中生长繁殖。接种时应先在照蛋器下检查鸡胚是否健康、活泼,并划出气室和接种部位。然后严格消毒接种部位和气室(先用碘酊消毒,再用70%酒精消毒),用打孔器打孔后,每胚接种处理好的接种材料0.2mL。接种后要用石蜡将孔口封死,放37℃环境

4、中继续孵育96h。不同病毒其接种部位、方法和培养时间不尽一样。(1)尿囊腔接种这是最常用的接种方法,鸡新城疫、减蛋综合征病毒、传染性支气管炎病毒、法氏囊病毒等均可采用这种方法。蛋壳消毒后,先在气室上打一小孔,再于胚胎一侧靠近气室处所画位点打一小孔,用带5~7号针头的注射器插入孔内约1.5cm,接种材料0.2mL。进针时针头与蛋壳应保持30℃角,不应垂直进针,注射完毕,立即用溶化的热石蜡将注射口和气室上小孔密封,然后放回37℃孵化箱孵化96h。并保证气室朝上。(2)绒毛尿囊膜接种该方法主要用于痘病毒、喉气管炎病毒和马立克氏病毒等的分离培养。

5、将卵壳消毒后,先在气室上打一小孔,再于胚胎侧靠近气室处避开大血管用钢锯条将蛋壳打开一个4mm见方的小口,用刀尖小心撬开蛋壳,不能损伤卵壳膜,形成卵窗。用针尖轻轻挑破卵窗中心的卵壳膜,但不能损伤卵壳膜下的绒毛尿囊膜。在针尖挑破处滴一滴灭菌生理盐水或甘油,然后用吸头在气室小孔上吸气,使胚内造成负压,这时卵窗处绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室,此时可见生理盐水或甘油迅速渗入。用注射器滴加2~3滴接种物于卵窗的绒毛尿囊膜上,以透明胶纸封住卵窗。气室小孔用石腊密封,接种后的鸡胚平放在孵化箱中,卵窗向上,不要转动。(3)卵黄囊接种此法适用于马立克氏病毒、

6、披膜病毒、衣原体及立克次氏体的分离、培养。接种方法:气室端蛋壳消毒后,在气室中央打一小孔,用带7号针头的注射器垂直刺入约3cm,注射接种物0.1~0.2mL。石蜡封口,继续在37℃孵化,每天翻蛋2次。6.接种后的孵化和观察接种后继续在37℃孵化,每天照蛋2次,死胚随时取出。一般24h内死亡的胚多因创伤或细菌污染所致,故弃去不用。24h以后死亡的胚,取出后放4℃冰箱,并作上记号。接种后的孵化时间长短随病毒种类不同而不同,一般新城疫病毒、支气管炎病毒、减蛋综合征病毒和法氏囊病毒要孵化48~120h,喉气管炎病毒、马立克氏病毒要孵化48~96h

7、,痘病毒要孵化4~5d,脑脊髓炎病毒要孵化至小鸡出壳。7.收毒接种鸡胚孵化到规定时间后,应从孵化器中取出放4℃环境冷冻36h左右,或在-10℃以下速冻4h左右,但不得使鸡胚冻结,否则易发生溶血。冷冻完毕按下列步骤收毒:(1)鸡胚放于蛋盘或蛋架上,气室向上,用碘酊、酒精消毒后,以无菌镊子敲开气室蛋壳或去掉人工卵窗的透明胶纸,暴露卵膜。注意不要让卵壳碎屑掉入鸡胚内。(2)根据接种部位,病毒种类或需要,收获相应的鸡胚材料如尿囊液、羊水、绒毛尿囊膜、胎儿、卵黄囊等,有时需要收获全胚(除去卵黄和蛋白),如新城疫病毒、马脑炎病毒等。尿囊液:气室打开后

8、,用无菌眼科镊子慢慢撕去卵壳膜,然后夹住绒毛尿囊膜轻轻提起,用巴氏吸管刺破绒毛尿膜直接吸取尿囊液。为防止羊膜堵住吸管口,可用镊子轻轻压下羊膜及胎儿,然后再吸。每个鸡胚一般可收8mL左右尿囊液。

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