层析介质的寿命与层析介质的清洗验证.pdf

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1、层析介质的寿命与层析介质的清洗验证前言在近20-30年生物技术在中国得到了迅猛的发展。随着生物制药技术的发展，生物药物的质量越来越得到重视。生物药物从研究到上市，其过程包括，实验室成果转化到临床试验，最终由患者广泛应用。药物研发成功的关键是药物的有效性，同时药物的安全性更为重要。我们需要在严格确保高质量的同时，不影响其有效性及工艺的稳定性。这就是法规部门的要求。清洗验证是工艺验证中的一项重要部分，验证是cGMP所要求的“证明任何程序、生产过程、设备、物料、活动或系统确实能导致预期结果的有文件证明的一系列活动”。在生物药物的生产过程中，层析技术是

2、其中最关键的步骤。生物药物通过培养，收集，经过层析介质的纯化，最终得到符合要求的生物药物产品。在生物制药的分离纯化过程中，培养的物料通过层析介质分离纯化，得到符合要求的目标产品。同时，物料中的杂质也污染了层析介质。这些污染物包括：宿主的蛋白、核酸、脂类，培养过程中的代谢产物、内毒素、杂菌以及可能的层析系统的泄漏，试剂中的杂质。这些污染物在下一次的分离纯化中将污染目标产品。所以必须去除或将其降低到安全水平。这就是我们所提到的层析介质的清洗(CIP)过程。通过您的试验证明清洗有效且污染物的残留已经降低到安全水平的工作就是清洗验证。层析介质是一种消耗

3、品，层析介质的经过一段时间使用，清洗后，污染物的残留量超过了安全水平，那么层析介质的寿命就到期了，只有更换新的层析介质才能保证生物药品的质量。1、层析介质寿命的影响因素：●物料的类型以及该层析介质所在工艺中纯化步骤●层析介质的类型●层析柱的维护●整个层析系统的组成●层析柱的装柱质量●试剂等的质量1.1物料的类型:物料是指生物生产过程中含有目标产品的料液。物料的类型是影响层析介质寿命的关键因素。不同的物料中含有的杂质不同。如：大肠杆菌的培养液中，培养液的上清液中约为10种蛋白，在外膜与内膜间的胞质中约含100种蛋白质，而细胞膜内的细胞质中含有20

4、00种蛋白质，在细胞质中还含有核酸、脂类等非蛋白的杂质。所以如果您的物料是大肠杆菌的细胞破碎液，那么杂质就相当的多了。由于蛋白的种类不同，所以在分离您的目标蛋白的时候，这些杂质可能发生沉淀、变性、聚集等变化，污染堵塞层析介质。又如：在抗体生产中使用ProteinA介质纯化。物料是CHO细胞表达的上清液。在培养过程中如果培养的条件控制较好，上清液的杂质相对较少，此ProteinA的介质寿命就会较长。但是如果CHO细胞培养条件控制不好，细胞裂解，细胞中的蛋白/核酸等杂质就会影响纯化的条件，介质的寿命就会受到影响。如果想要延长介质的使用寿命，就必须使

5、用较强烈的清洗条件清洗层析介质。例如:NaOH或优化清洗剂的条件等。Streamline介质的设计用于捕获步骤，所以此介质易受杂质的污染，在清洗时需优化清洗试剂及步骤。物料：杂交瘤细胞上清层析介质：STREAMLINErProteinA在位清洗步骤：A:1.0mMNaOH，2MNacl溶于20%的乙醇中，处理2小时，2500px/h流速B:5%月桂酰肌氨酸钠，20mMEDTA，0.1MNaCl，20mMNaH2PO4,pH7.5处理1.5小时C:50mMHAC，20%乙醇1.2层析介质所在的纯化工艺中的步骤：在纯化的工艺开发过程中，我们建

6、议采用三步法纯化工艺。捕获→中度纯化→精纯→半成品。在三步纯化工艺中，不同的纯化步骤，其纯化工作的目的不同。捕获步骤主要的目的是：从大量的杂质中捕获目标样品，缩小样品的体积，以便于后续的纯化工作。所以此步骤的工作面临的是物料中有大量杂质。所以此步骤层析介质的清洗需要比较强烈的试剂，因此捕获步骤的层析介质的寿命相对较短。在表1中血浆白蛋白纯化过程中使用的离子交换介质在不同的分离步骤中，DEAESepharoseFastFlow阴离子交换介质，在此工艺中为捕获作用；CMSepharoseFastFlow为阳离子交换介质，工艺中为中度纯化；这两步离子

7、交换均为3个循环做一次CIP。但是用于捕获步骤的阴离子交换介质DEAESepharoseFastFlow的寿命明显短于中度纯化的CMSepharoseFastFlow介质。1.3不同类型的层析介质：层析介质是由层析介质的基价(骨架)配合各种配基形成不同原理的层析介质。凝胶过滤介质没有配基；离子交换、疏水的配基为小分子的配基;亲和介质的配基一般为特殊的蛋白质。亲和介质的配基一般稳定性稍差，不耐受酸、碱等较强的清洗条件，所以对清洗的条件要求比较严格，较强的试剂清洗可能导致配基的脱落或降解。但是温和的试剂的清洗效果较差，这就造成层析介质的寿命缩短。M

8、abselectSuRe为新一代重组ProteinA的亲和介质。对原有的ProteinA的氨基酸序列作了突变。使其耐受0.1-0.5MNaOH，从而可