示差折光-液相色谱法测定蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶残留量.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第10期2012年10月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl602～1606示差折光一液相色谱法测定蜂蜜中呋喃果糖苷酶残留量王艳吴斌张晓燕沈崇钰张睿李丽花费晓庆赵增运(江苏出入境检验检疫局食品实验室，南京210001)摘要基于呋喃果糖苷酶与棉子糖在柠檬酸一氢氧化钠缓冲介质(pH4．50)中50℃下反应16h后的酶解产物蜜二糖含量的变化，建立了高效液相色谱示差折光检测(HPLC-RID)技术测定蜂蜜中呋喃果糖苷酶残

2、留量的新方法。以AgilentCarbohydrate柱为分离柱，乙腈一水(78：22，V／)为流动相，流速为1．4mL／min，检测器为示差折光检测器，柱温和检测器温度均为35℃。结果表明，蜂蜜样品经过聚丙烯酰胺凝胶柱分离后，样品峰形得到简化，灵敏度提高了1．3倍；方法的线性范围为10~200U／kg；测出限为10U／kg；回收率为81．3％～112．4％；相对标准偏差为3．7％～9．7％(一6)。当蜂蜜样品中呋喃果糖苷酶含量>20U／kg时，判定为阳性样品，即掺假蜂蜜。关键词呋喃果糖苷酶；蜂蜜

3、；示差折光；液相色谱；掺假1引言天然纯正蜂蜜因其具有较高的营养价值]，受到众多消费者的青睐。但一些不法商贩，为了谋取利润，在蜂蜜中加入糖浆、白砂糖、蜂蜜香精等物质，不仅影响了蜂蜜原有的营养价值，也损害了我国蜂产品在国内外市场上的信誉。目前，测定蜂蜜掺假的方法主要有C一稳定同位素分析法]、高效液相色谱法]、薄层色谱法(TLC法)L7]和红外光谱法等。C一稳定同位素分析法主要包括元素分析同位素比值质谱法(EA-IRMS)和液相同位素比值质谱法(LC-IR／VIS)[9。EA-IRMS法只能测定掺杂C4

4、植物糖含量较高的蜂蜜样品，对于鉴别掺杂少量c3植物糖的蜂蜜样品存在缺陷。针对这一问题，费晓庆等提出了液相色谱／元素分析一同位素比值质谱联用技术，进一步提高了鉴别蜂蜜掺假的能力。TLC法测定掺入甜菜糖浆的蜂蜜有局限性。在加工掺有甜菜糖浆的蜂蜜过程中，人为添加了呋喃果糖苷酶，该酶非蜂蜜本身所具有，用于酶解甜菜糖浆，可以催化水解其p-D一果糖苷键，将其转化为一分子葡萄糖和一分子果糖。借助以上方法无法鉴定真蜂蜜与这种掺有甜菜糖浆的蜂蜜的成分区别。针对这种情况，本研究建立了一种检测蜂蜜中呋喃果糖苷酶方法，为

5、蜂蜜打假鉴别提供了一种新的监控手段，具有重要的现实意义。本方法对蜂蜜样品进行了净化，去除了样品中的果糖，促进反应的正向进行，灵敏度提高了1．3倍。由于本方法根据酶解产物蜜二糖的含量进行定量分析，而非果糖和葡萄糖的含量，因此，大大提高了方法的准确性。2实验部分2．1仪器、试剂及样品1200高效液相色谱仪，配示差折光检测器(Agilent公司)；Carbohydrate色谱柱(150mm×4．6mm，5um，Agilent公司)；恒温水浴振荡器(太仓实验仪器厂)；pH计(Mettler-Toledo公

6、司)；涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)；0．45m水相滤膜和0．22m有机相滤膜(上海百赛生物科技有限公司)。Bio—Gel~P一2聚丙烯酰胺凝胶(0．45～0．16mm粒径，BIO-RADLaboratories公司)；NaOH、一水合柠檬酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；五水棉子糖(纯度为98％，北京中棉紫光生物科技有限公司)；蜜二糖(纯度为99．8％)，p-呋喃果糖苷酶(CAS号：9001-57—4，332．8U／mg)，购于美国Sigma公司；乙2012-02-10收稿；2012-0

7、4-18接受E-mail：wangyan6064@126．tom第lO期王艳等：示差折光一液相色谱法测定蜂蜜中呋喃果糖苷酶残留量腈(色谱纯，德国Merck公司)。实验用水均为18．2MQ超纯水。天然蜂蜜样品：油菜蜜、洋槐蜜、荆条蜜、椴树蜜；实际蜂蜜样品：来自日常检测样(由国内不同地区的蜂农或者蜂蜜供应商提供)。2．2溶液配制20％棉子糖溶液：准确称取20．0g五水棉子糖，用超纯水溶解并定容至100mL，摇匀备用(临用现配)。呋喃果糖苷酶储备液1．0g／L(333U／mL)：准确称取呋喃果糖苷酶标准

8、品0．01g(精确到O．0001g)，用水溶解并定容至10mL，摇匀备用。此储备液稀释300倍后作为工作溶液使用，于0～4℃保存。柠檬酸缓冲溶液：称取21．01g柠檬酸于1000mL烧杯中，加800mL水溶解后，用1mol／LNaOH溶液调节至pH4．50，以水定容至1000mL。2．3填料处理和装柱填料处理：称取适量填料于烧杯中，加水溶解，轻轻晃动烧杯(勿用玻棒等搅拌)使其溶解，室温下静置过夜，使其充分溶胀。用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，再加水放置4h后，用吸管吸去上层悬浮液，此