电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的相关参数的筛选.pdf

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1、中国海洋大学学报第42卷第1O期42(10)：065～O7O2012年1O月PERI()DICAl0FOCEANUN1VERSITY()FCHINAOct．，2O12电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的相关参数的筛选商文聪，赵泊淞，陈亮，孙妍，张玲玲，胡晓丽，包振民(中国海洋大学贝类分子遗传学与育种技术研究室，山东青岛266003)摘要：电刺激可诱导卵子雌核发育，但在海洋生物中尚无报道。为获得电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的最佳条件，采用正交设计的方法，分别研究了电场强度、电容、脉冲次数、卵子密度及缓冲液种类对诱导效果的影响。结果表明：(1)不同缓冲液的诱导效果差异不显著(P2

2、>0．o5)，但甘露醇缓冲液的诱导效果优于Zimmerman氏缓冲液和山梨醇缓冲液；最佳卵子密度为11．25×10个／mL，场强的最适范围为1．()()～1．75kV／cm。最优电刺激诱导条件组合是：0．30mol／L甘露醇缓冲液，卵子密度11．25×10个／mL，脉冲强度1．20kV／cm，电容3／aF，2次电脉冲。(2)应用优化后的电刺激参数诱导雌核发育，获得了最佳的诱导效果，得到的卵裂率为28．16，胚胎存活率为98．37。本研究首次成功应用电刺激法诱导了栉孔扇贝的雌核发育，并得到了单倍体胚胎，初步建立了栉孔扇贝中该诱导法的参数体系。关键词：栉孔扇贝；雌核发育

3、；电刺激；卵裂率；胚胎存活率中图法分类号：Q953．1文献标志码：A文章编号：1672—5174(2012)10—065—06人工诱导雌核发育(Artificialinductionofgyno—的浓度梯度而进入卵胞质，引发钙库释放钙离子或者胞genesis)是指采用物理、化学或生物方法，在雄核不参质钙离子的迅速转移_6，从而模拟正常受精时钙离子与合子形成的情况下，卵子依靠自身雌核的遗传物质规律性的波动现象启动卵子发育[1。但迄今为止，该方发育成胚胎的过程。开展人工诱导雌核发育的研究，法在海洋生物雌核发育研究中，尚无报道。本研究首次对快速建立纯系，并进而开展遗传育种

4、研究具有重要尝试采用电刺激法诱导栉孔扇贝雌核发育，对其诱导参价值。此外，雌核发育后代由于其遗传物质完全来源数及雌核发育过程中的细胞学机制进行初步探索，旨在于母本一方，所以也是研究性别遗传机制、基因一着丝建立电刺激诱导栉孔扇贝雌核发育的技术方法。粒重组、基因作图及克隆的珍贵材料ll1]。l材料与方法在海产经济贝类方面，人工诱导雌核发育的研究主要是通过使用各种辐射或化学方法灭活精子，从而1．1材料诱导卵子的雌核发育。目前已在近十种海洋经济贝类栉孑L扇贝分别于2010年和、2011年5月取自青岛中进行了人工诱导雌核发育的研究l2]。同源精子灭活市沙子口，2龄贝，壳高6～8

5、cm。Hoechst购自Beyo—法难以排除外源精子基因组的干扰，所以近年来有学ti‘me公司。者尝试采用异源精子诱导来消除这种干扰，如在栉孔栉孔扇贝取回后洗刷干净，暂养于14℃循环海水扇贝[3-4]、盘鲍l_等贝类中的研究。然而，异源精子诱中，雌雄个体分开暂养，蓄养期间每天升温1℃，至导依赖于物种的特异性，且受多种环境因素的影响，如16~17。C恒温待产。精卵的不同成熟度等，另外卵子的激动也往往不同步，采用阴干升温法，2O℃海水中催产获得卵子，经而且如果灭活不充分的话，其实仍有精子污染的问题，500目的筛绢过滤收集，根据实验需要调整卵子的密度。因此限制了其在雌核发

6、育中的应用。同样的催产方法得到精子，受精时调节好精卵的比例。与传统的同源或异源精子诱导法相比，电刺激诱电刺激缓冲液配方如下：导法在整个过程中不需要精子的参与，能彻底排除外(1)甘露醇缓冲液(含0．05mmol／LCaC1，0．1源精子基因组的干扰，是理想的诱导方法。该方法已mmol／LMgC12，0．5mmol／IHepes和lA0BSA)，其在兔、猪、鼠和牛等哺乳动物中被广泛应用并取得了很中甘露醇浓度根据实验需要调整。大的成功_6。。其机制是采用电刺激的方式，使卵母细(2)Zimmerman氏缓冲液(含有0．1mmol／LCa(C2胞膜上形成可逆微孔，缓冲液中的钙

7、离子顺细胞内外H302)2H2O，1mmol／LK2HP，0．5mmol／LMg(一*基金项目：国家自然科学青年基金项目(30901096)；国家高技术研究发展计划(2012AA10A402)；国家科技支撑计划项目(2011BAD13B062011BAD13B05)；现代农业产业技术体系建设专项资金；山东省农业良种工程资助收稿日期：2012—0322；修订FI期：2012—0715作者简介：商文聪(1986一)，女，硕士生。Email：shangwencong@163．COrn**通讯作者：E—mail：zmbao@OUC．edu．cn中国海洋大学学报H3O2)