DNA提取方法和步骤.doc

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1、DNA提取方法和步骤1.取1—2cm2幼叶，装入1.5ml离心官中加液氮。（实际应用时，用1-2g经避光24小时[去淀粉]的嫩叶）2.冷冻后，迅速研磨成粉末，在化冻前加入600ul预热到650C的DNA提取液。（研磨时用经打磨后的玻璃棒在离心管中捣碎）3.于650C，20rpm离心1小时。（人工摇匀即可）4.冷却至室温，加500ml氯仿/异戊醇（24：1）混匀（不可振荡，但可颠倒，混匀至溶液成乳浊状）5.40C，10000rpm，离心10min。6.**取上清液，加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀（用宽口吸头取上清液至新离心管，不可过猛振荡，

2、约混30min）40C，10000rpm，离心10min。7.取上清液，加等体积氯仿/异戊醇（24：1）混匀（用宽口吸头取上清液至新离心管，不可过猛振荡，约混30min）40C，10000rpm，离心10min。8.加2倍上清液体积的100%乙醇于新离心管中，缓缓加入上清液，可见DNA出现。9.用一事先剪去尖端的灭菌吸头钩出DNA。10.用1ml70%乙醇（-200C）洗涤DNA，钩出，干燥。11.干燥后加60ulTE（含RNA酶1ul1mg/ml）溶解DNA，消化（除去）RNA，室温保持30min12.加180ulTE,240ul氯仿/异戊醇

3、（24：1）混匀.13.40C，13500rpm，离心5min。14.取上清液，加1/10体积,3mol/l乙酸纳(ph=5.5)，2倍体积95%乙醇（-200C），30-40min。15.钩出DNA75%乙醇洗涤，钩出16.用50ulTE溶解。▲DNA提取液500ml100ml400ml1mol/lTris-Hcl(pH=8.0)50ml10ml40ml0.5mol/lEDTA(pH=8.0)50ml10ml40ml5mol/lNacl50ml10ml40ml10%SDS(或20%SDS)62ml/31ml12.4ml/6.2ml49.6ml

4、/24.8mlddH2O269ml/238ml53.8ml/47.6ml255.2ml/230.4ml亚硫酸氢纳（NaHSO3）1.9g0.38g1.52g▲3mol/lNaAc(pH=5.5)用NaAc.3H2O40.81g加ddH2O溶解，用冰乙酸调至PH=5.5，加ddH2O定容至100ml，分装后高压灭菌20min,于40C保存。▲TE(pH=8.0,含10mmol/lTri-Hcl,1mmol/lEDTA)配制：1mol/lTris-Hcl(pH=8.0)1ml0.5mol/lEDTA(pH=8.0)0.2mlddH2O98.8ml▲

5、药品：1.Tris(三羟甲基氨基甲烷)1mol/l2.EDTA（乙二胺四乙酸）0.5mol/l1.NaCl5mol/l2.SDS（十二烷基硫酸纳）20%3.NaHSO34.氯仿5.异戊醇6.100%乙醇7.ddH2O8.RnaseA10mg/ml注：1mol/lTris：在800mlddH2O中溶解121.1gTris碱加浓盐酸调节至pH=8.0(应使溶液冷至室温后调定pH)加水定容后分装，高压灭菌，若溶液出现黄色，则不合格。10%SDS：在900mlddH2O中溶解100克，电泳相SDS，加热至68度助溶，加入几滴浓盐酸，调节PH=87.2加

6、水定容1L分装备用。0.5mol/lEDTA：在800ML水中加入186.1克的二水乙二胺四乙酸钠（EDTA.Na.H2O）在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节PH=8.0（约20克颗粒NaOH）定容1L，分装高压灭菌备用。RnaseA:将RnaseA溶于10mol/LTris.Cl(PH=7.57),15mmol/LnaCl溶液中，配成10mg/ml的浓度。于100度加热15分钟（除去Dnase活性，防止降解DNA），缓慢冷却至室温，分装，-20度保存。