共结晶和X射线衍射.doc

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1、共结晶和X射线衍射1)晶体筛选的准备工作①蛋白样品的准备蛋白样品PTP1B来源于某某试剂公司，将蛋白质样品于4℃，12,000rpm离心1min，加液时取上清与池液(Wellbuffer)混合。②结晶试剂盒的准备分别用Indexl-96、Crystalscreen、CrystalscreenⅡ、SaltRx、WizardⅠ、WizardⅡ、WizardⅢ、PEGion、PEGRx-1、PEGRx-2和Natrix约600个条件进行晶体生长的初筛。③PTP1B/HPN复合物晶体培养及优化结晶实验均采用悬滴气相扩散法在4℃、10℃、22℃各温度恒温

2、下进行，根据初筛结果根据初筛结晶结果对环境温度、盐类种类、蛋白浓度、沉淀剂浓度、缓冲液种类以及pH值等多种结晶条件来进行优化得到可以衍射的晶体。对于得到的复合物晶体可进行初步的x射线衍射，根据分辨率大小确定晶体质量以便改变筛选条件以达到优化目的。晶体生长条件初筛所用蛋白浓度为10mg/ml,蛋白所在缓冲液为MES50mMpH6.5,NaCI100mM。使用准备的结晶试剂盒进行晶体生长条件的初筛，晶体初筛时生长第一周中第1、3、7天进行观察，第二周后隔周观察一次蛋白质结晶情况，通过悬滴优化以获得更高分辨率的蛋白质晶体。优化结晶条件一般采用三个步骤

3、:在初筛最佳晶体条件附件，作pH和沉淀剂浓度的二维梯度；对蛋白悬滴液加入添加剂来优化晶体；对环境温度进行温度梯度的优化尝试。另外对个别晶体较小或者形状不好的晶体进行种晶操作以期获得形状更好的晶体。2）PTP1B/HPN复合物晶体x射线衍射实验利用常规光源或同步辐射光源收集X射线晶体衍射数据，进行衍射分析前，先筛选合适的冷冻保护液，再挑取晶体短暂浸泡于冷冻保护液后装上衍射仪。①衍射数据的收集在对晶体数据进行收集之前，需要先对晶体衍射质量进行预实验，选取衍射质量较好的晶体进行低温冷冻，然后利用同步辐射光源进行数据收集工作，数据收集的过程如图所示。P

4、TP1B/HPN复合物晶体衍射数据的收集在。。实验室进行。室内X射线光源为Rigaku公司生产的MicroMax-007HF室内X射线发生器。该设备采用旋转铜靶作为阳极，激发的X射线波长为。。Å，使用时电流和电压分别为20mA和40kV。X射线的聚集镜采用Rigaku公司生产的Osmic系统。衍射数据收集探测器采用的是Marresearch公司的mardtb成像盘系统。数据收集在100K的低温氮气环境中进行。数据收集采用回摆法，回摆角和每幅衍射图的步进角度均为1°，共收集照片200张。PTP1B/HPN晶体衍射最高分辨率为。。Å，对所收取数据的

5、第一张衍射图使用HKL2000程序包初步确定晶体的晶胞参数和晶格类型。①衍射数据的分析。。。。。。。。。。。。。。。模拟所用的蛋白质晶体结构来源于PDB数据库/布鲁克海文数据库，删除晶体结构中的水分子及多余配体，使用DSmodeling进行分子对接，依据受体表面的结合点与配体分子的距离匹配原则，将配体分子HPN投映到受体分子表面，计算其结合的模式和亲和力，使用打分函数对计算结果进行打分，评判配体与受体的结合程度，挑出配体亲和力最佳的构象。