2005版药典无菌检查法方法验证及操作要点.ppt

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1、2005版药典无菌检查法方法验证及操作要点饶春意1前言1.1定义无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。1.2实验环境条件要求无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统

2、按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。2.培养基2.1培养基的灭菌配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。2.2培养基的保存制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中一般可在一年内使用。2.3培养温度硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。改良马丁培养基置23～28℃培养。2.4培养基的适用性检查无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。2.4.1无菌性检查每批培养基随机取

3、不少于5支(瓶)，培养14天，应无菌生长。2.4.2灵敏度检查菌种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌株传代次数不得超过5代培养基接种每种菌接种至2管相应的培养基，另取一支不接种作空白对照，按规定温度时间培养。结果判断空白对照管应无菌生长，每种菌接种后的2管培养基管均生长良好，该培养基的灵敏度检查符合规定。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌接种至硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养3天；白色念珠菌、黑曲霉接种至改良马丁培养基中23～28℃培养5天。3.稀

4、释液、冲洗液及其制备方法0.1％蛋白胨水溶液pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液4.方法验证试验目的:1)证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查2)确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。3)确保在实际检验条件下，该供试品的无菌检查法的准确性、有效性和重现性。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。4.1菌种1）金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]2）铜绿假单胞菌(Pseudomonasaerugznos

5、a)[CMCC(B)10104]3）枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]4）生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]5）白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]6）黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]4.2菌液制备制备的菌液，一般当日使用。金黄色葡萄球菌（铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌)营养肉汤（或营养琼脂培养基）生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃培养18～24小

6、时；白色念珠菌改良马丁培养基（或改良马丁琼脂培养基）23～28℃培养24～48小时上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于l00cfu(菌落形成单位)的菌悬液。黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数小于l00cfu的孢子悬液。4.3薄膜过滤法将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入试

7、验菌（小于100cfu），过滤。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一滤桶，不过滤供试品，其它操作同上，作为对照.将含培养基的容器按规定温度培养3～5天。各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。金葡铜绿白念金葡铜绿白念加供试品对照管枯草生孢黑曲霉枯草生孢黑曲霉4.4直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接人小于l00cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于l00cfu的白

8、色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接人规定量的供试品，另1管作为对照，按规定的温度培养3～5天。4.5结果判断与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检验条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用1)增加冲洗量，