病毒转基因技术原理 腺相关病毒.ppt

《病毒转基因技术原理 腺相关病毒.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、主要内容腺相关病毒简介腺相关病毒载体转基因技术原理腺相关病毒载体的医学应用优缺点总结和复习思考题第一节腺相关病毒简介生物学特性致病性与免疫性第一部分生物学特性血清型病毒结构病毒复制对理化因素的抵抗力血清型AAV是从腺病毒的污染物（1965年）、人群或非人灵长类动物等的组织中分离鉴定到的。共鉴定了11个AAV血清型以及108个AAV变株（variants）。通过签名PCR（signaturePCR）技术，利用高度保守序列扩增Cap基因的一小段可变区的DNA序列，以筛检是否是新的AAV分离株，然后利用PCR技术获得新的AAV分

2、离株的Cap或（和）Rep基因的全长序列。在人类、非人灵长类动物、马、猪、牛、绵羊、山羊和蛇等的不同组织器官，发现了大量的具有多样性的AAV的基因组。但新分离的病毒株，尚未进行血清学分型，通称为变株。AAV不同血清型和变株的基因组结构相对较为保守，与AAV-2型较为类似，不同血清型的衣壳蛋白结构中表位的差异。50~80%AAV-2抗体在人群中检测出。转导不同组织器官的AAV最优血清型组织最优血清型肝脏AAV-8,AAV-9骨骼肌AAV-1,AAV-7,AAV-6,AAV-8,AAV-9中枢神经系统AAV-5,AAV-1,A

3、AV-4肺脏AAV-9心脏AAV-8肾脏AAV-2胰腺AAV-8眼睛（光受体细胞）AAV-5,AAV-4不同血清型在吸附细胞表面能力、病毒受体、胞内交通和抗原性等方面具有明显的区别，以及针对不同组织和细胞的转导效率不一致，体现出不同的组织极性（tissuetropisms）病毒结构AAV-220–30nm，基因组为线性、单链的DNA分子。正链和负链的单链DNA分子，以同等效率包装在病毒体衣壳中。基因组全长4679个核苷酸。基因组包括两个ORF，三个启动子（启动子以在基因组中处的作图位置标示，分别为p5、p19和p40启动子

4、），以及两末端为145个核苷酸的反向末端重复序列（invertedterminalrepeat，ITR）ITRITR中的前125个核苷酸具有回文结构，其中还存在两个小的内部回文结构，可自身折叠后经碱基配对、形成T字形的发夹结构；剩余的20个核苷酸，保持非配对状态，称为D序列（Dsequence）。ITR中还具有Rep结合元件（Repbindingelements，RBEs)RBE和RBEˊ，以及一个末端解离位点TRS（terminalresolutionsite）等重要序列。ITR是在AAV生物学中重要的顺式（cis）作用

5、活性元件，在病毒复制中具有重要作用：在非容许条件下，ITR在病毒复制的负调控中起关键作用；在容许条件下，作为病毒基因组复制的起点和引物。ITR对病毒基因组的包装、转录、以及位点特异性的整合，均是必需的。左端的ORF（Rep基因）可编码四个Rep蛋白，即Rep78，Rep68，Rep52和Rep40，均具有螺旋酶和ATP酶活性。较大的Rep蛋白如Rep78和Rep68，由P5启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，具有链和位点特异的核酸内切酶活性（切割点在TRS附近）以及位点特异的DNA结合活性（结合于RBE）。因此

6、它们是重要的调节蛋白，以反式（trans）方式参与调节AAV复制周期的所有阶段，如DNA复制、位点特异性整合、整合病毒基因组的拯救，调节病毒和细胞内基因表达的启动子等。较小的Rep蛋白如Rep52和Rep40，由P19启动子指导转录，分别由未剪辑和剪辑的转录物产生，参与单链DNA的聚集并包装入病毒体的衣壳。右端的ORF（Cap基因）由P40启动子指导转录，产生两个转录物，可编码三个病毒衣壳蛋白，即VP1，VP2和VP3。这些衣壳蛋白利用共同的ORF，但转录起始位置不一致。一般而言，VP1、VP2和VP3的分子比是1：1：8

7、/10。构成这些病毒体的衣壳蛋白的比例的差异，最有可能会影响病毒的感染性，尤其是VP1含量低的情况下。缺乏VP1的病毒体没有感染性。病毒复制八个主要步骤：与细胞表面受体黏附或结合内吞（endocytosis）在细胞内经内吞体运输释放出内吞体进入胞核脱壳并释放病毒基因组启动双链DNA的合成整合到细胞染色体或以附加子形式持久表达病毒基因不同血清型的AAV感染的细胞类型不同，这取决于不同血清型的AAV靶向细胞表面的受体的差异。而且这也决定了不同血清型的病毒在细胞内的不同的运输途径AAV病毒的糖苷受体和辅助受体AAV血清型受体和辅

8、助受体AAV-1α2–3/α2–6NlinkedSAAAV-2HSPG,FGFR1,HGFR,integrins,37/67kDaLamRAAV-3HSPG,37/67kDaLamRAAV-4α2–3OlinkedSAAAV-5α2–3NlinkedSA,PDGFRAAV-6HSPG,α2–3/α2–6