自噬基因Beclin1对宫颈癌HeLa细胞顺铂敏感性的影响.pdf

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1、现代妇产科进展2013年2月第22卷第2期ProgObstetGyneeol，Feb．2013，Vo1．22，No．2·短篇论著·自噬基因Beclin1对宫颈癌HeLa细胞顺铂敏感性的影响王赞宏，白淘，张晶(1．山西医学科学院山西大医院妇产科，太原030032；2．山西医科大学第一医院，太原030001)【摘要】目的：研究自噬基因Beclin1对宫颈癌细胞株HeLaJl顶铂敏感性的影响并探讨可能的机制。方法：将自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3．1(-4-)．Beclinl经脂质体包裹后转染人宫颈癌HeLa细胞。荧光定量PCR(RT．PCR)和Weste

2、rnblot分别检测Beclinl及凋亡因子caspase．3mRNA和蛋白的表达水平，M，ITI1法检测顺铂对HeLa细胞的半数抑制浓度(IC。)，Hoechest染色检测细胞凋亡。结果：pcDNA3．1(+)．Beclinl转染HeLa后，Beclin1mRNA和蛋白相对表达增加(P

3、可以通过促进细胞凋亡提高宫颈癌HeLa细胞对顺铂的敏感性。【关键词】Beclin1；顺铂；自噬；凋亡；宫颈癌中图分类号：R737．31文献标志码：A文章编号：1004—7379(2012)02—0146—04宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，近年上海生工生物工程技术公司合成。人宫颈癌细胞株HeLa由来呈年轻化趋势，是导致妇女死亡的重要因素。放本实验室保存。1．2Beclinl真核表达质粒的构建Beclin1真核表达质粒疗影响了生育期妇女的卵巢功能，新辅助化疗越来pcDNA3．1(+)一Beclin1的构建由本实验室自行完成J。越受到关注，尤其在局部晚期宫颈癌治疗中，

4、以铂类1．3细胞培养人宫颈癌细胞株HeLa培养于含10％小牛为基础的治疗方案提高了患者的生存率⋯。化疗血清的DMEM培养基中，37~C、5％CO2孵箱中培养至对数药物多通过诱导凋亡促进肿瘤细胞死亡，但肿瘤细生长期。胞经常发生突变对抗凋亡，自噬性细胞死亡的引入1．4脂质体介导质粒瞬时转染用lipofeetamine2000脂质提供了新的治疗靶点。自噬是一种非caspase依赖体在6孑L培养板中进行转染，按说明书操作。质粒DNA和脂质体用量分别为3g、7．5l，将无血清培养基稀释的脂质的程序性细胞死亡，自噬异常与肿瘤形成有关。Be．体分别与pcDNA3．1(+)一Becl

5、in1和pcDNA3．1(+)等体积混clin1基因是哺乳动物参与自噬的特异性基因，目合，室温孵育30rain，加至各培养孔，37℃孵育6h，更换血清前已被确定为一个候选抑癌基因，在多种肿瘤中表培养基终止转染，48h后收集细胞，分别命名为pcDNA3．1现为单等位基因缺失J。本研究中我们将Beclin1(+)一Beclin1组、pcDNA3．1(+)组，另设未转染质粒组为空真核表达载体转染宫颈癌细胞株HeLa，观察Beclin白对照组。1在HeLa中的过表达对其顺铂敏感性的影响，并探1．5荧光定量PCR(RT—PCR)用Trizol试剂盒提取总RNA，用随机引物逆转录

6、成cDNA后，进行PCR扩增，以讨可能的机制。GAPDH为内对照。Beclin1上游引物5~AGGAACTCA．1材料与方法CAGCTCCA1TrAC一3，下游引物5，_AATGGCTCCTCTCCT—1．1材料peDNA3．1(+)质粒载体(oligoengine)，BglⅡ，GAGTT-3，扩增片段长度为220bp；GAPDH上游引物5，_EcoRI，HindIl，q'4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶，DI2000TGGGTGTGAACCAcGAGAA一3，下游弓I物5~GGCATGGACT．DNAMarker(Takara)，琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取纯G

7、TGGTCATGA一3，扩增片段长度为250bp。PCR条件：94℃化试剂盒、RNA抽提及RT—PCR试剂盒(Fermentas)，Mono-2min变性后，按下列热循环参数：94oC20s，54oC30s，72℃dansylcadaverin(MDC，Sigma)，兔抗人Beclinl多克隆抗体40s，共45个循环。从荧光定量PCR动力学曲线判读荧光阈BECN1(SantaCruz)，兔抗人caspase一3、PARP单克隆抗体值循环数(cyclethreshold，Ct)值，根据Livak和Sehmittgen的(CellSignaling)，顺