高分辨率熔解曲线分析法检测食源性副溶血性弧菌.pdf

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1、现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2013，Vo1．29，No．9。___IL—同Cj分辨率熔解曲线分析法检测食源性副溶血性弧菌章丽’，余以刚，赖富饶’，吴晖’，杨锡洪，肖性龙’(1．华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)(2．广东温氏佳润食品有限公司，广东云浮527400)摘要：为建立一种快速鉴定副溶血性弧茵的HRM(高分辨率熔解曲线)real-timePCR法，以toxR为靶基因，结合特异性引物，通过优化反应体系殁条件，进行特异性、敏感性及重复性评价，并初步应用于90份送检的鲜活

2、海产品样本的检测。特异性谈脸表明，该方法能选择}生检测副溶血弧菌，T值为76．64i~0．57℃；而与创伤弧菌、霍乱弧茵、金黄色葡萄球菌等多种海产品中常见的食源性病原菌没有交叉反应。灵敏度试验表明，该方法最少可检测toxR重组质粒的浓度为3．50xl02copies／mL。重复性试验表明，同一样品于试验内及试验问的平均Tm值分别为76．53：~-0．35℃和76．74~-0．52℃，变异系数分别为0．56~-0．42％和1．1li-0．73％。对90份鲜活海产品样本的检测证实该法可使阳性检出率从国标法的14．44~／d~高至18．8

3、9％。本研究所建立的副溶血性弧菌HRMreal-timePCR法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点，能应用于食品样本的检测，具有很好的研究价值和应用前景。关键词：副溶血J}生J弧菌；高分辨率熔解曲线；检测；实时PCR；荧光文章篇号：1673．9078(2013)9．2288-2293RapidDetecti0n0fVibrioparahaemolyticusbyReal··timePCRusingHighResolutionMeltingCurveAnalysisZHANGLi~YUYi-gang，LALIFu．rao，WUHu

4、i~，,YANG)【i-]H0ng2，ⅪoXing-long(1．CollegeofLightIndustryandFoodScience，SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510640，China)(2．GuangdongWlen’sCarenFoodCo．，Ltd．，Yhnfu527400，China)Abstract：Arapidreal-timePCRme~odfordetectingHbHoparahaemolyticus(byhighresolutionmeltingcu

5、rveanalysis(HRM)wasdeveloped．ApairofspecificprimerstargetingthetoxRgeneofHbrioparahaemolyticuswasused．Afteroplimizingthereactionsystemandconditions，thespecificityofthemethodwasvalidatedwith10targetsl／'al~and10non-targetswains，Serialdilutionsfrom3．50x10to3．50~107copies／

6、mLpurifiedconstructedplasmidswereanalyzedtoevaluationitssensitivity．Reproducibilityassaywasalsoconductedonpurifiedconstructedplasmidsbetween1．50~10and1．50x10’copies／mL．Themethodwasappliedtodetect90livesubmittedseafoodsamples．TheresultsshowedthatthedevelopedHRMreal-time

7、PCRassayhadagoodspecificitybydetectingonlyVPwiththevalueof76．64~-0．57℃andwasnotafectedbyotherseafoodpathogenssuchasHbHovulnifcus，Hbriocholerae,Staphylococcusaureuseta1．ThesensitivityofdetectionoftheconstructedplasmidsWgl"e3．50~102copies／mL．Inaddition,theassayhadahighre

8、producibilityandtheaverageTmvalueswere76．53士o．35℃and76．74-4-0．52℃．Thesample’svariations(CVs)were0．56：~0．42％and1．11：~0