酒精性肝病患者尿液代谢组学研究.pdf

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1、·44·黑龙江医药科学2013年loft第36卷第5期酒精性肝病患者尿液代谢组学研究孙长海，陈百慧，王蒙(佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯154007)摘要：目的：建立用于酒精性肝病的早期无创诊断方法。方法：采用高效液相色谱一质谱联用技术，结合正交偏最小二乘分析(OPLS)法，确定酒精性肝病患者尿液中生物标志物。结果：筛选出对分组贡献较大的36种潜在生物标记物，其中鍪定出7种可能的化合物，分别为肌酐、吲哚一3一羧酸、吲哚一3一乳酸、L一色氨酸、L一丝氨酸、L一亮氨酸、谷胱甘肽。结论：尿液代谢组学方法可用于酒精性肝病的早期无创诊断。关键词：酒精性肝痛；代谢组学，正交偏最小二乘法

2、；高效液相色谱一质谱联用中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：1OO8—0104(2013)05一oo44一O2酒精性肝病(AlcoholicliverDisease，ALD)，是由于长期其他内分泌疾病，药物或酒精成瘾者，有精神疾患者。并在体大量饮酒，直接对肝脏造成损害，引起肝细胞反复发生脂肪检报道出来后核对研究对象的健康状况。变性、坏死和再生，最终导致脂肪肝、肝纤维化和肝硬化等一健康志愿者共22例，男12例，女1O例，年龄为25～65岁。系列病变L1。寻找特异的早期诊断标志物是提高酒精性肝3实验方法与结果病治疗疗效的关键。因此，酒精性肝病的早期诊断及发病机3。1样品

3、采集与预处理制的研究对治疗酒精性肝病具有十分重要的意义。鉴于生物研究对象采集样品前一天禁酒，女性避开月经期，禁食体内大部分代谢产物均通过尿液排出，而且尿液采样简单、不禁水至少12h；样品收集时间在清晨8：00～10：00AM；尿杯无创伤性、易于接受[3“]。本研究建立了基于高效液相色谱一取样品于10mL离心管。在一4℃、16000rpm·min的条件下质谱联用技术的酒精性肝病患者尿液代谢组学研究方法，分离心10min，离心两次，取上清液，用封口袋包装，储存于一析酒精性肝病患者和健康志愿者尿液代谢图谱的差异，对获80~C冰箱中保存备用。运输过程中利用干冰进行冷藏。分析取的数据

4、应用正交偏最小二乘分析(OPLS)法进行模式识时，将尿样从一80~C冰箱中取出解冻，在一4℃、16000rpm·别，确定酒精性肝病早期诊断和治疗相关的代谢标记物，为rain的条件下离心10min，取上清液，用0．22m滤膜过滤，代谢组学的研究用于酒精性肝病的早期诊断及治疗上提供制得供试样品，用于HPLC的测定分析。了可行的方法。3．2色谱条件1仪器与试剂色谱柱为EC-C18柱(4．6×100IDmm，2．7m粒径)，美Agilent1200型高效液相色谱仪，Agilent色谱工作站，国Agilent公司；C保护柱(5×2．1IDmm)，非罗门公司；流Agilent6300型

5、电喷雾离子阱型质谱仪(美国Agilent公司)；动相A为0．1％甲酸水，流动相B为乙腈：起始梯度为0％乙乙腈、甲醇为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；甲腈，在15min内乙腈线性增加至3O％，14min内乙腈线性增加酸为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；实验室用水至i00％并维持lmin。流速为0．6mL·min一，柱温30~C。进样为娃哈哈纯净水。量为4OL。2研究对象3．3质谱条件2．1对象来源离子阱电喷雾源(Es1)，正离子扫描模式，干燥气流量为酒精性肝病患者的尿液样本均来自于2O1O—O9～201110L·min_。，干燥气流温度为325℃，雾化器压力为

6、40psi一O9期间佳木斯大学附属第一医院和佳木斯中心医院住院(275．8kPa)，毛细管电压为4000V，数据采集范围为5O～患者。健康志愿者的尿液样本均来自于2O1O一0g～2011—091000m／z。期间佳木斯大学附属第一医院和佳木斯中心医院体检中心3．4方法学考察所有采样的健康志愿者均记录年龄、性别等基本信息，并进3．4．1仪器精密度试验行实验室检查和影像学检查。研究对象在采样前一个月内未参与其他研究。取一份尿液样品，在确定的色谱条件下连续进样6次，进2．2对象选择标准样量4OL。记录指纹图谱数据，并利用相似度软件计算其相2．2．1酒精性肝病患者关系数。所测得的各

7、图谱与其均值的相关系数均大于0．98，各图谱能够很好的重合。结果表明仪器的精密度较好。纳入标准：根据2001年7B中华肝脏病学会，脂肪肝、酒3．4．2方法重复性试验精性肝病学组制定的《“酒精性肝病诊断标准”草案》临床确诊为由酒精引起的肝病，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒取同一尿液样品6份，在确定的色谱条件下分别进样，进精性肝硬化的患者。样量4OL。记录指纹图谱数据，并利用相似度软件计算其相排除标准：非酒精性引起的肝病，以及糖尿病、甲亢等代关系数。所测得的各图谱与其均值的相关系数均大于o．97，谢性疾病的患者。酒精