膀胱癌血清及尿液代谢组学研究.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)特约来稿第9期2012年9月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1322一l328DOI：10．3724／SP．J．1096．2012．20045膀胱癌血清及尿液代谢组学研究陈永婧王小华黄真真林琳高瑶朱尔一邢金春郑嘉欣杭纬(厦门大学化学化工学院化学系，厦门361005)(厦门市第一医院泌尿科，厦门361005)摘要应用代谢组学研究方法，对与膀胱癌(Bladdercancer，BC)发病相关的生物标志物进行筛选，采用液相色谱

2、一电喷雾质谱(LC-ESI／MS)联用技术对20名膀胱癌患者与24名正常人的血清和尿液进行研究。多变量统计分析结果表明，膀胱癌患者和正常人聚类明显，血清和尿液中分别发现13个潜在标志物。其中，(2E，6E，8E)一二十二碳三烯一1一醇、7-((IS，2S)一2-(庚胺)环己基)庚酸和(11E,14E，17E)一三烯一二十碳一l一醇首次在血清中发现，有潜力成为膀胱癌诊断标志物。液相色谱一质谱联用结合多变量分析的代谢组学研究技术在膀胱癌诊断中展现出巨大潜力。关键词液质联用；膀胱癌；血清；尿液1引言膀胱

3、癌(Bladdercancer，BC)是世界十大常见癌症之一。尽管其病因学和致病危险因素已经被广泛研究，但是由于其高复发率和较大的临床复杂性，使得BC诊断和治疗较困难]。基于BC不同阶段和临床表现，对于早期患者，其存活率高达约95％；然而对于晚期患者存活率降低到50％左右。因此，早期诊断、治疗会大大提高患者的存活率。代谢组学在发现潜在生物标志物和改善膀胱癌早期诊断方面有独特的前景。它借助先进的分析仪器和统计工具对多种疾病进行标志物检测和研究，但用代谢组学方法研究膀胱癌的报道相对少见】。在膀胱癌的研

4、究中，尿液由于其特殊性，一直被作为首选的检测样品。目前报道的潜在生物标志物大多来源于尿液[8】。血清中几乎涵盖了身体各个器官和组织的代谢物，所以应重点筛查。本研究对膀胱癌患者的血清和尿液两种样品同时进行研究，扩大了生物标志物的筛选范围。此外，反相色谱(Reversedphaseliquidchromatography，RPLC)和亲水作用色谱(Hydrophilicinteractionliquidchromatog—raphy，HILIC)联合使用，将进一步增加筛选的代谢物数目及种类Ⅻ。2实验部

5、分2．1试剂与材料表1样品统计信息乙腈、甲醇(色谱纯，Merck公司)；甲酸(Fluka公Table1Demographicdataofsamples司)；醋酸铵(Tedia公司)；超纯水(18．2MI2·cm)；0．22m滤膜(Agilent公司)；所有标准品均购自Sigma-Aldrich公司。所有血清和尿液样品来自20例膀胱癌患者和24例健康志愿者，由厦门市第一医院依据规范，按照合理的操作流程提供，采集后存于一80℃。分析前，所有样品在室温下解冻。样品统计详细信息如表1所示。2．2实验方法2

6、．2．1样品前处理在150血清中加入事先预冷的甲醇450laL，漩涡混合，沉淀蛋白；于一2O℃静置2012-01—13收稿；2012-03—20接受本文系国家基础科学人才培养基金(No．J1030415)项目和福建省科技厅(No．2009D023)资助E-mail：weihang@xlnu．edu．tom第9期陈永婧等：膀胱癌血清及尿液代谢组学研究10min；于4℃以12000g离心10min，取上清液，以滤膜(0．22m)过滤。在200L尿液中加入800L超纯水，用于RPLC—MS分析。在100

7、尿液中加入400L乙腈，用于HILIC—MS分析，用乙腈稀释的目的在于避免产生“Waterplug”效应，以减少对色谱分离的影响】。从处理后每一例样品中取15L，合并组成质量控制(Qualitycontrol，QC)样品。每隔5个样品分析QC和空白样品，以检验分析方法的重现性和色谱上样量。2．2．2色谱分析方法RPLC和HILIC分析均采用Ultimate一3000高效液相色谱系统(Dionex公司)。KinetexCl8色谱柱(100mm×2．1mm×2．6m，Phenomenex公司)用于反相

8、分离。反相色谱流动相A：0．1％(v／v)甲酸溶液；流动相B：0．1％(V／V)甲酸一乙腈溶液；RPLC流速：300~tL／min。亲水分离采用XBridgeTMHILIC色谱柱(150mm×2．1mm×3．5ktm，Waters公司)。流动相A：含0．1％(v／v)甲酸及10mmol／L醋酸铵溶液；流动相B：0．1％(V／V)甲酸一乙腈溶液；HILIC流速：200~tL／min。在整个色谱分析过程中，血清上样量为15，尿液上样量为20L。优化的RPLC和HILIC色谱条件见表2。