超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞移植治疗兔急性胰腺炎的磁共振活体示踪-论文.pdf

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1、November2013,Vo1．13,No．1l·1419·中国药物与临床2013年11月第l3卷第11期ChineseRemedies&Clinics,——·基础研究·超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞移植治疗兔急性胰腺炎的磁共振活体示踪张瑞平姜增誉李健丁重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，SAP)是由各间层MSCs，加入到含5ml培养基的无菌离心管中。常温下种原因引起胰酶被激活，导致胰腺组织自身消化、水肿、出血以1000r／min离心洗涤l0min，弃去上清，取细胞沉淀。细胞和坏死的炎症反应，常继发感染性腹膜炎、休克、

2、全身炎症反沉淀中加入含20％胎牛血清的L．DMEM培养基，调整细胞密应综合征和多器官功能障碍综合征等严重并发症，预后极度约1~106／ml，接种于25cm细胞培养瓶，在37℃，体积分差[1]。目前的治疗措施主要是对症治疗、支持治疗、预防胰腺数为5％CO：，饱和湿度恒温细胞培养箱中培养。48h后更换感染和坏死，疗效仍不佳。近年来，骨髓间充质干细胞(mes—培养基。去除未贴壁细胞，以后视细胞生长情况每3—5d换enchymalstemcells．MSCs)移植治疗急性胰腺炎的实验研究液1次。待贴壁细胞约90％时，用0．25％的胰蛋白酶消化，按认为MSCs可

3、分化为有功能的胰腺干细胞，对损伤的胰腺进1：2传代后继续培养，用倒置相差显微镜观察细胞形态。取第行修复。为治疗重症SAP提供了一种新的思路和手段，而细3代细胞．分别与一抗(抗CD29、CD34、CD44、CD45单克隆胞移植后在活体内示踪成为随之而来的研究难点。近年来，抗体)室温反应30min，PBS液洗涤后重悬细胞，1％多聚甲醛随着超顺磁性氧化铁(SPIO)纳米颗粒标记细胞技术的成熟，固定15min，然后进行流式细胞仪检测。磁共振成像(MRI)活体示踪SPIO标记细胞成为新的研究热1．4MSCs的磁标记：多聚左旋赖氨酸(PLL)与SHO混悬点【=I]

4、。本实验拟采用SPIO标记兔MSCs并移植入SAP模型兔于培养液中(PLL和SPIO的终浓度分别为1．5I~g／ml和250行MRI扫描．探讨干细胞移植治疗SAP过程中，MRI活体示Ixg／m1)，将SPIO．PLL复合物分别以1：4与培养基混合，使铁踪移植干细胞的可行性。的终浓度为50Ixg／ml，加入到第3代MSCs培养液中进行标1材料和方法记，置于37℃、体积分数为5％CO：培养箱中孵育过夜。以未1．1实验动物：选12只体质量600～700g的健康新西兰大标记细胞作为对照组。白兔，雌雄不拘，由山西医科大学实验动物中心提供。1．5建立模型：参照文献

5、[4]建立SAP模型，将实验兔固定1．2主要试剂和设备：SPIO纳米颗粒为德国Schering公司后常规消毒、铺巾，在无菌条件下，模型兔沿腹门线正中切口生产的Resovist：1．4ml／支．含铁浓度0．5mmol／ml，铁颗粒直进腹，暴露胰十二指肠及胆总管。找到十二指肠乳头部，给予径(5O±5)nm。德国Siemens公司的1．5TSonataMRI系统。美丝线缝扎(胰管结扎)，胆总管中段丝线结扎，结扎处上段置国Hyclone公司的达氏修正伊氏培养基(DMEM)，杭州四季人头皮针尾部的塑料管，引流胆汁。乳头缝扎处上段同样置青生物工程材料有限公司的胎牛

6、血清，天津化学试剂三厂的人头皮针尾部的塑料管作为胰胆管引流管。用2ml注射器从普鲁士蓝。胆总管引流管抽取胆汁，注入胰胆管引流管，动脉夹夹闭此1．3MSCs的体外分离、培养、传代和鉴定：用3％戊巴比妥钠引流管5～10min，完成胰腺炎模型制作。30mg／kg经兔耳缘静脉麻醉，无菌操作下，分别在双侧髂骨1．6移植细胞和MRI：造SAP模型后随机分为2组．每组6上部穿入骨髓穿刺针，共抽取骨髓3～4ml。将抽取的骨髓加只。SAP造模后第2天，经兔耳缘静脉各组分别注入细胞悬入到含5ml磷酸盐缓冲液(PBS)的无菌离心管中，充分混液和PBS液。实验组：用微量注射器

7、将含有1xl06个SPIO标匀。常温下2000r／min离心15min，吸弃上清及脂肪层，再加记的MSCs的细胞悬液50l缓慢注入；对照组：注射入50入4mlPBS液，充分混匀。将上述悬液缓慢加到含4ml比重IxlPBS液。随机抽取各组模型兔，在细胞移植后5、10、15d1．077g／LPereoll淋巴细胞分离液的无菌离心管中。常温下以分别进行MRI。2000r／rain离心15min，可见离心管内液体分为3层。收集中1．7损伤组织普鲁士蓝染色：模型兔经MRI后处死，取胰腺组织。将胰腺组织块置入4％多聚甲醛溶液中浸泡、固定，然DOI：10．11655

8、／zgywylc2013．11．010后经冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，行普鲁士蓝染色。