动物生物化学课件-核酸及其分析技术.ppt

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1、第二单元核酸及其分析技术核酸以5种核苷酸为单体通过磷酸二酯键连接的多聚体，可称之为多聚核苷酸。脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类DNA：是主要的遗传物质在真核细胞中，DNA主要存在于细胞核内的染色体上。少量的DNA存在于线粒体中（mtDNA)RNA参与蛋白质合成主要存在于细胞质中。胞核中有少量，集中于核仁依据其功能主要有三类：信使RNA（mRNA），转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）核酸的种类和分布核酸的基本组成单位：单核苷酸单核苷酸=碱基+戊糖+磷酸（一）碱基主要是嘧啶碱基和嘌呤碱基两类DNA:胸腺嘧啶（T）

2、,胞嘧啶（C）,腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）RNA:尿嘧啶（U）胞嘧啶（C）,腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G）核酸中还有一些含量甚少的稀有碱基（或修饰碱基）（二）核糖核糖属于戊糖，RNA中含的糖是核糖；DNA中所含的是2′脱氧核糖（三）磷酸核酸的化学组成核苷酸是由核苷中戊糖的5′-OH与磷酸缩合而成的磷酸酯，它们是构成核酸的基本单位分成两大类，即核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，前者是构成RNA的基本单位，后者是构成DNA的基本单位。核苷酸分子中核糖5′位含有一个磷酸基的称为核苷一磷酸，如腺苷一磷酸（AMP）。它可进一步磷酸化形成相应的腺苷二磷酸（AD

3、P）和腺苷三磷酸（ATP）核苷酸还参与能量代谢，或作为辅酶的成分，参与细胞信息传递（如cAMP）。核苷酸（一）核酸的一级结构DNA分子的一级结构是由许多脱氧核糖核苷酸以磷酸二酯键连接起来的.在形成的多核苷酸链上，具有游离5′-磷酸基的一端称为5′-末端，具有游离3′-OH的一端称为3′-末端。碱基当量定律在DNA分子中，A与T、G与C的摩尔比都接近为1，称之为碱基当量定律在RNA分子中，A-U，G-C配对核酸的结构以碱基当量定律为基础，1953年Watson和Crick提出要点：DNA分子是一个右手双螺旋结构①两条平行的多核苷酸链，以相反

4、的方向,围绕着同一个中心轴，以右手旋转方式构成②疏水的嘌呤和嘧啶碱基平面层叠于螺旋的内侧，亲水的磷酸基和脱氧核糖以磷酸二酯键相连形成的骨架位于螺旋的外侧。③每10对核苷酸绕中心轴旋转一圈，螺旋的螺距为3.4nm④大沟和小沟交替出现⑤两条链被碱基对之间形成的氢键稳定地维系在一起在双螺旋中，碱基总是腺嘌呤与胸腺嘧啶配对，用A=T表示；鸟嘌呤与胞嘧啶配对，用G≡C表示。（二）DNA的二级结构——双螺旋模型①DNA微溶于水，呈酸性，不溶于有机溶剂，因此常用有机溶剂（如乙醇）来沉淀DNA。②由于DNA分子很长，在溶液中呈现黏稠③DNA易断裂成碎片。

5、难以获得完整大分子DNA**④DNA具有紫外吸收特性，在260nm处有最大吸收值，利用这一特性可以定性、定量分析测定核酸。⑤溶液状态的DNA易受DNA酶的作用而降解。脱去水分的DNA性质十分稳定。核酸的性质在理化因素的作用下碱基对之间的氢键断裂，DNA的双螺旋结构分开，成为两条单链的DNA分子。变性后的DNA，其生物学活性丧失，260nm处的紫外光吸收值升高（增色效应），黏度下降，沉降系数增加，比旋下降常将50%的DNA分子发生变性时的温度称为解链温度或熔点温度（Tm）影响Tm值的因素①DNA的性质和组成。均一的DNA，Tm值范围较小。非

6、均一的DNA，Tm值较宽；G-C碱基对含量愈高的DNA分子则愈不易变性，Tm值也大。②溶液的性质。DNA在离子强度低的溶液中，Tm值较低，转变的温度范围也较宽。核酸的变性DNA的变性是可逆过程，在适当的条件下，变性DNA分开的两条链又重新缔合而恢复成双螺旋结构，这个过程称为复性分子杂交不同来源的单链DNA或RNA，经复性处理时，它们之间互补的或部分互补的碱基序列可以配对，形成DNA/DNA或DNA/RNA的杂合体而形成杂交分子。这个过程称为分子杂交核酸的复性其原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们在一起温浴时，其相应

7、的同源区段将会退火形成双链结构。几种重要的分子杂交技术1．Southern-blot:检测被转移DNA片段中特异的基因2．Northern-blot:是将RNA分子从电泳凝胶转移并结合到适当的滤膜上，通过与标记的单链DNA或RNA探针杂交，以检测特异基因的表达。3.斑点印迹杂交4.原位杂交核酸分子杂交核酸分析技术常用的核酸工具酶有限制性核酸内切酶、DNA连接酶、碱性磷酸酶及DNA聚合酶等限制性核酸内切酶原核细胞分离的一类核酸内切酶.能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构，切割后可在切口处留下具有互补关系的单股D

8、NA，称为粘性末端。核酸工具酶聚合酶链式反应（PCR）：即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，又称为基因的体外扩增DNA的拷贝数可以大规模地扩增是DNA分子在体外克隆的