耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a的原核表达及多克隆抗体的制备.pdf

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1、国际检验医学杂志2012年i月第33卷第1~IntJLabMed,January2012,Vo1．33,No．1——·论著·耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a的原核表达及多克隆抗体的制备金妹，朱祖怀，闫佩毅，邹玉涵，朱元，黄德魁，朱晴晖(上海市普陀区人民医院：1．检验科；2．心内科200060)摘要：目的研究耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的原核表达，及PBP2a多克隆抗体的制备。方法根据基因文库登录的mecA基因的编码序列，设计合成了1对寡核苷酸引物，应用PCR法从MRSA基因组中获得编码PBP2a全长的DNA，将此

2、目的基因片段克隆至pET32a(+)载体，转化E．coliBL21(DE3)；经异丙基一t?-D-~代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达后，利用Niz亲和层析技术纯化目的蛋白；用目的蛋白免疫小鼠3～8次后，收获血清并鉴定。结果成功构建了PBP2a原核表达栽体，并获得了高效表达；利用纯化的蛋白制备了理想的多克隆抗体。结论利用分子克隆技术，获得了高纯度的PBP2a蛋白并制备了多克隆抗体，为其进一步研究奠定了基础。关键词：葡萄球菌，金黄色；青霉素结合蛋白质类；原核表达DoI：10．3969／j．issn．1673—4130．2012．01．001文献标识码：A文

3、章编号：1673—413O(2012)01—0001—03ProkaryoticexpressionofPBP2aofmethicillinresistantstaphylococcusaureusandpreparationofitspolyclonalantibodyJinShu，ZhuZuhuai，YahPeiyi，ZouYuhan，ZhuYuan，HuangDekui，ZhuQinghui(1．DepartmentofClinicalLaboratory；2．DepartmentofCardiovascularMedicine，ShanghaiP

4、eoplesHospitalofPutuoDistrict，200060，China)Abstract：ObjectiveToexpressthePBP2aofmethicillinresistantstaphylococcusaureus，andprepareitspolyclonalantibody．MethodsAccordingtothesequenceofmecAgenepublishedonGenBank，primersweredesignedandsynthesized．ThefulllengthofmecAgenewasobtainedb

5、yPCR，andthenthegenewasclonedintopET32a(+)plasmid，andtherecombinantplasmidwastransformedintoE．eoliBL21(DE3)．TheexpressionwasinducedbyIPTGandtheexpressedproductwaspurifiedbyNiaffinitychromatography．Micewereimmunedwiththepurifiedproteinfor3to8times，andmiceserumwascollectedforidentif

6、ication．Re-suitsTherecombinantexpressionvectorforPBP2awasconstructedsuccessfully，andPBP2aproteinwashighlyexpressedinpro—karyoticexpressionsystem．Thepurifiedproteinwasusedtopreparepolyclonalantibody．ConclusionUsingmolecularcloningtechnology，purifiedPBP2aproteincanbeobtainedandprep

7、areitspolyclonalantibody，whichestablishesthefoundationforfurtherinvestigation．Keywords：staphylococcusaureus；penicillin-bindingproteins；prokaryoticexpression由于广谱抗菌剂的广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌1材料与方法(MRsA)在临床分离的葡萄球菌中的比例不断增加，已发展成1．1材料为医院内严重感染的主要病原菌之一[1]。自1961年初首次1．1．1菌株MRSA临床分离株于甘油培养基中一7O℃保发现

8、MRSA以来，MRSA的感染正以惊人的速度在全世界范存。E．coliDH、BL2