线粒体CO基因克隆.doc

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1、线粒体COI基因的分子克隆一、试剂材料1、500一800克重的活鲤鱼和1500一2500克重的活草鱼各五条2、STE缓冲液(0.25mol/L蔗糖，10mmol/LTris·HCI，1mmol/LEDTA，pH8.0)1L3、STM缓冲液(0.25mol/L蔗搪，10mMTris·HCl，0.5mmol/LMgcl2，PH8.0)50mL4、DNasel2mg5、0.5mol/LEDTApH8.010mL6、NTE缓冲液(20mmol/LNaCI，20mmol/LTris·HCI，lmmol/LEDTA，pH8.0)50mL7、20%SDS8、苯酚50ml9、3m

2、ol/LNaAC(pH4.8)5mL10、冷乙醇(100%)50mL11、95%乙醇200Ml12、TE缓冲液(10mmol/LTrisHcl，1mmol/LEDTA，pH8·0)，10mL13、10mg/mlDNA一freeRNaseA溶液（溶解RNaseA于TE缓冲液中，浓度为10mg/mL，煮沸10～30min,除去DNase活性，-20℃贮存）40ul14、氯仿:苯酚:异戊醇(Vl:V2:V3为24:24:l)49ml(24+24+1)1、引物1、引物22、10×PCR缓冲液（Buffer）3、2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP

3、各2mM4、Taq酶5、琼脂糖：1.0%；6、电泳缓冲液（50×TAE电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/LEDTA(pH8.0)20ml，加蒸馏水至100ml）7、溴化乙锭EB：5µl/100ml8、溴酚蓝指示剂14、限制性内切酶BamHI、EcoRI、HindII、HindIII和Pstl，16、氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加水至1000ml,若配置固体培养基，则再加入15g Agar(琼脂)。）17、pUC19质粒DNA19、杆菌HB101菌株，20、感受态细胞HB1

4、01。二、工具材料1、剪刀5把不同大小2、镊子5个不同大小3、烧杯2个大的4个小的4、移液管（一般用移液枪）5、离心管10个最大的6、培养皿5个小的10个大的7、三角锥瓶4个6、定容瓶2个50mL1个1L7、试管架1个三、设备材料1、高压灭菌锅2、无菌操作台3、冰箱4、水浴锅5、离心机6、玻璃匀浆器7、凝胶电泳系统8、紫外透射检测仪9、PCR仪9、缺口转译标记试剂盒，10、质粒DNA限制酶消化分析及杂交探针系统11、硝酸纤维素滤膜13、同位素P32标记的水稻线粒体Col探针紫外透射检测仪四、实验步骤（一）鱼肝线粒体DNA的分离与纯化1、按上面所写准备实验材料2、对

5、实验器材灭菌3、对鱼预处理刮鳞消毒取鱼肝用STE缓冲液清洗4、再加入STE缓冲液到玻璃匀浆器里冰浴中缓和匀浆5、离心转头在3000g离心30分钟6、除去上层脂肪和管底细胞碎片取上清液继续离心20000g离心30分钟得到粗提的线粒体沉淀。7、加入20mlSTM缓冲液2mgNasel25℃水浴中保温消化30分钟8、取0.8ml0.5mol/LEDTApH8.0溶液加到消化液中，使终浓度为20mmol/L，终止酶解反应。9、然后再加入160mlSTE缓冲液，20000g下离心20分钟，收集线粒体沉淀，重复用STE缓冲液漂洗线粒体二次，清除污染的核DNA10、把离心所得的

6、线粒体沉淀悬浮在20ml的NTE缓冲液，加入20%SDS溶液至终浓度为0.8%，放置在37℃水浴中保温10分钟。11、用等体积的苯酚抽提脱蛋白二次，留水相，12、用10分之1的3mol/LNaAC和二倍体积的冷乙醇(100%)，混匀后放在一20℃冰箱中沉淀过夜。13、离心收集mtDNA，真空干燥后溶于2.0ml的TE缓冲液,加入40ul(10mg/ml)的DNA一freeRNaseA溶液置37℃水浴中保温60分钟。14、消化液再用氯仿:苯酚:异戊醇抽提2一3次。水相加乙醇沉.淀DNA，并将离心收集的mtDNA经真空干燥后，溶于适量的TE缓冲液中，贮于—20℃冰箱备

7、用。（二）线粒体COI基因的克隆1．PCR扩增（1）在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。10×PCRbuffer5μldNTPmix（2mM）4μl引物1（10pM）2μl引物2（10pM）2μlTaq酶（2U/μl）1μlDNA模板（50ng-1μg/μl）1μl加ddH2O至50μl视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油（防止PCR过程中蒸发）。（2）调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃变性40s→58℃退火30s→72℃延伸60s，循环30-35次，最

8、后在72℃