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1、目录摘要1ABSTRACT11引言21.1RSAP标记技术21.2DNA提取方法21.3PCR反应原理及成分32材料与方法42.1材料42.1.132个花生品种42.1.2主要试剂52.1.3主要仪器用具52.2方法52.2.1花生DNA的提取52.2.2PCR反应体系的优化62.2.3PCR反应条件中退火温度的确定62.2.4引物初步筛选72.2.5多样性检测73结果及分析83.1PCR反应体系的优化83.1.1引物浓度对扩增结果的影响83.1.2模板浓度对扩增结果的影响83.1.3TaqDNA聚合酶浓度对扩增结果的影
2、响93.1.4dNTPs浓度对扩增结果的影响93.2退火温度对扩增结果的影响103.3引物筛选结果113.4多样性初步分析114讨论124.1RSAP特点124.2影响RSAP因素13致谢14参考文献1514RSAP标记技术在花生遗传多样性检测中的初步应用摘要：限制性位点扩增多态性(restrictionsiteamplificationpolymorphism,RSAP)是根据基因组内普遍存在的酶切位点来设计特殊的引物,通过简单的梯度PCR反应来产生多态性。本研究首次建立了适合于花生RSAP分析的PCR反应体系和反应条
3、件,并对RSAP标记技术在花生遗传多样性检测中的应用进行了初步研究。利用所建立的体系，使用15对引物对32个花生DNA进行了PCR扩增,经过重复验证,有8对引物能够扩增出清晰且稳定的条带，这些条带具有一定的多态性，说明所建立的体系可用于花生遗传多样性分析。关键词：RSAP；花生；遗传多样性TheApplicationofRSAPMarkerTechniqueinDiversityDetectionofpeanutStudentmajoringinbiotechnologyLiPengfeiTutorQiaoLixianA
4、bstract:Restrictionsiteamplifiedpolymorphism(RSAP)requiresjustasimplepolymerasechainreaction(PCR)togeneratepolymorphicmarkersaroundrestrictivesite.AnRSAPanalyticsystemsuitforpeanutwassetupandappliedindiversitydetectionofpeanutforthefisttime.Inthisexperiment,fifte
5、enprimerpairswerescreenedwith32peanutvariesbytheRSAPanalyticsystem;andeightofthemproducedstableandreproducibleamplificationpatterns.Someofthefragmentsscreenedbytheprimerpairswerepolymorphic,indictingthattheanalyticsystemwassuitforthediversitydetectionofpeanut.Key
6、words:RSAP;peanut;diversity141引言花生是世界范围内广泛种植的重要油料作物之一，营养价值高，用途广，深受人们喜爱。中国花生世界年产量居世界第一位（万书波，2003）。随着中国加入世贸组织和现代交流的国际化，选育更加高产，高油，抗逆性强，早熟或其他专用型花生品种变得尤为重要（王传堂，1999）。传统的育种方式存在周期性长，对隐性基因控制的性状不易筛选等局限性，而我国对花生在分子生物学方面的研究还相对落后于其他作物（孙大容，1998）。因此，探索花生基因组研究方法对于花生遗传育种研究和加速野生种的
7、利用有其重要意义，RSAP作为一种新型的分子标记技术，简便且具有潜力。1.1RSAP标记技术RSAP(restrictionsiteamplificationpolymorphism)即限制性位点扩增多态性,是通过简单的梯度PCR反应,针对基因组内普遍存在的酶切位点来产生多态性标记。RSAP的引物是依据SRAP(sequencerelatedamplifiedpolymorphism)(序列相关扩增多态性)的引物设计原理建立(LiG,etal.,2001)，使用1对17-18个碱基组成的引物序列,5′端前12-14个碱基
8、为没有特殊组成的填充序列,3′端的选择性碱基为4-6个碱基组成的限制性内切酶的酶切位点序列。依据引物内3端选择性碱基,即基因组内限制性内切酶位点的不同而产生多态性。该技术无需限制性酶切及其它复杂步骤,仅1个简单的PCR反应即可实现对DNA限制性位点的多态性进行检测,因此它是RFLP技术的1种简化。该技术由杜晓华等首先
