柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2真核表达质粒的构建及在细胞中的表达.pdf

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1、中国动物传染病学报2015，23(2)：53—59ChineseJoumalofAnimalInfectiousDiseases·研究论文·柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2真核表达质粒的构建及在细胞中的表达杨斯涵他，赵其平2，韩红玉2，朱顺海，李莎，翟颀，梁思婷，杨亮宇，黄兵，董辉(1．云南农业大学动物科学技术学院，昆明650201；2．中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241)摘要：为构建柔嫩艾美耳球虫沉默信息调节因子2(Eimeriatenellasile

2、ntinformationregulator2，EtSIR2)的真核表达质粒，以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子cDNA为模板，PCR扩增~EtSIR2基因，PCR产物经酶切回收纯化目的片段后与经相应酶切的真核表达栽体pCAGGsL-*c~-。连接产物U~PCR和酶切鉴定，再经测序鉴定正确后，分别转染DF一1细胞和BHK细胞进行表达，用Westemblot和间接免疫荧光鉴定sIR2基因的表达情况。结果表明：成功扩增了sIR2基因，长度为909bp；Westernblot可见大小约为37kDa的表达蛋白条

3、带；间接免疫荧光可以检测到特异性绿色荧光，表明成功构建TEtSIR2的真核表达质~pCAGGs—EtSIR2，并能在哺乳动物细胞和禽类细胞中表达。该研究结果为深入研究EtSIR2的生物学特性和球虫DNA疫苗的研制打下了基础。关键词：柔嫩艾美耳球虫；沉默信息调节因子2；DF．1细胞；BHK细胞；真核表达中图分类号：$852．723文献标志码：A文章编号：1674—6422(2015)02—0053-07CoNSTRUCTIoNANDEXPRESSION0FEUKARYoTICEXPRESSIONPL

4、ASMIDCoNTAININGSILENTINFoRMATIoNREGULAToR2GENEoFEIMERIATENELLAYANGSi．han，，ZHAOQi—ping，HANHong—yu，ZHUShun—hai，LISha，ZHAIQi，LIANGSi．ting，YANGLiang—yu，HUANGBing，DONGHui(1．ColZegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201．Chin

5、a,"2．KeyLaboratoryofAnimalParasitology,MinistryofAgriculture，ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,CAAS,Shanghai200241，China)Abstract：Thefu11．1engthcDNAofsilentinformationregulator2ofEimeriatenella(EtSIR2)wasamplifiedinPCRfromthecDNAofthesecond—generati

6、onmerozoitesinordertoconstructtheeukaryoticexpressionplasmid．ThePCRproductsandpCAGGsvectorsweredigestedwiththesamerestrictionenzymesandligated．TherecombinantEfSIR2plasmidwasconfirmedthroughPCRenzymedigestionandsequencingandthentransfectedintoDF—lcells

7、andBHKcells．respectively．TheexpressionofrecombinantESIR2inthetransfectedcellswasexaminedinindirectimmunofluorescenceassay(IFA)andWestemblot．Theresultsshowedthatthe1fSIR2genewas909bpinlength．WesternblotalsoindicatedthattheantiserumtorecombinantErSIR2st

8、ronglyrecognizedaproteinwithmolecularmassat37kDainthetransfectedcells．SpecificgreenfluorescencewasobservedinIFA．ConstructionandeukaryoticexpressionofEfSIR2haslaidthefoundationforfutureresearchonbiologicalfunctionsandDNAvaccine．Keywords：Eimeria