犬细小病毒蜂胶灭活苗的制备及治疗用卵黄抗体的研制.pdf

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1、一288一江苏农业科学2010年第3期鲁敏，张婧兰，黄克和．犬细小病毒蜂胶灭活苗的制备及治疗用卵黄抗体的研制[J]．江苏农业科学，2010(3)：288—290犬细小病毒蜂胶灭活苗的制备及治疗用卵黄抗体的研制鲁敏，张婧兰，黄克和。(1．江苏省协同生物工程责任有限公司，江苏南京210041；2．南京农业大学动物医学院，江苏南京210095；3．南京大学生命科学学院，江苏南京210093)摘要：将犬细小病毒(cpv)的弱毒苗接种于单层FS1细胞上，大量增殖病毒，并制成CPV蜂胶灭活苗。其后对蛋鸡进行连续3次免疫，定期收集鸡蛋，提取蛋黄中的卵黄抗体(I

2、gY)。应用ELISA方法检测CPV卵黄抗体效价，结果表明，通过本方法能获得稳定的犬细小病毒卵黄抗体，10d后抗体水平维持在1：320以上。关键词：犬细小病毒；蜂胶灭活苗；卵黄抗体；ELISA中图分类号：$852．655文献标志码：A文章编号：1002—1302(2010)03—0288—03犬细小病毒病是由犬细小病毒(canineparvovirus，CPV)碳酸盐缓冲液)、洗涤液(PBS—T，pH值7．4)、封闭液引起的以剧烈呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少为主要特(1％BSA)、酶标抗体HRP一兔抗鸡IgY(博奥森生物有限公征的一种高度接触

3、性传染病，在幼犬中具有相当高的发病率司)、底物缓冲液(pH值5．0磷酸一柠檬酸钠缓冲液)、底物与死亡率。利用超免鸡将CPV特异性抗体稳定持续地传至邻苯二胺(OPD)(南京博全科技)、终止液(2mol／LH：SO)。卵黄中，制备特异性多克隆抗体，成本低且产量高，有望成为1．2试验方法治疗犬细小病毒病的有效手段。与产生于哺乳动物的IgG相1．2．1血清浓度对CPV在FS1细胞上增殖的影响FS1细比，来自禽的IgY具有许多独特的优点：(i)无需采血，只需胞长满后用0．05％EDTA和0．25％胰酶消化，取100mL细收集免疫母鸡产下的鸡蛋即可获得抗体；

4、(2)使用少量的抗胞培养瓶9个，分为3组，在接种细胞的同时接种病毒，接占原免疫禽类即可获得大量的质量均一的特异性IgY；(3)由于培养液量10％的弱毒苗，1、2、3组分别为含2％、5％、8％小种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之牛m清的DMEM培养液，37℃、5％CO：培养24h后换含小间不会发生交叉血清学反应；(4)不激活哺乳动物的补体系牛血清2％的DMEM维持液。定时将每组的3个培养瓶的毒统，不与类风湿因子或Fc受体相结合，避免在免疫检测过程液取出，混匀取样0．5mL后，剩余毒液均放回培养瓶中继续中产生假阴性或假阳性结果；(

5、5)耐热、耐酸，巴氏灭菌温度培养，如此反复取毒，测定毒液的TCID。。收毒：下也不会失活，并且试验发现，IgY活性在pH值3～3．5时活一20oC／37℃反复冻融3次后，4℃下3000r／min离心性才发生下降，且胃蛋白酶的破坏作用小，因此IgY能口服；20rain，收集上清液作为毒种。(6)安全。服用IgY安全可靠，用治疗剂量(80300mg／kg)的1．2．2测定病毒的TCID。各时间段采集的毒液及毒种按10—40倍剂量进行试验，没有发现毒性反应。本试验通10～～10的浓度梯度稀释后，每个梯度以维持液10％的量过大量增殖CPV病毒，制备蜂胶灭

6、活苗，免疫蛋鸡，获得较高同步接种于F81细胞，37℃培养，逐日观察细胞CPE，具体操效价的CPV卵黄抗体，并对抗体水平进行监测，旨在为其在作及计算方法见参考文献[5]。生产及犬临床上的应用提供科学依据。1．2．3病毒鉴定中和试验：以浓度为1O的毒种与等量的CPV单克隆抗体37℃下感作30min，并用等量的10浓1材料与方法度毒种作对照，分别同步接毒F81细胞后进行观察。1．1试验材料1．2．4蜂胶灭活疫苗的制备(1)将收集的毒液加终浓度CPV疫苗(英特威公司生产)；F81细胞(南京农业大学为0．1％的甲醛(边加边振荡，使其充分混匀)，置37℃灭活

7、动物医学院提供)；CPV单克隆抗体(北京世纪元亨动物防疫18—24h，每2h振荡一次，4℃保存。(2)称取蜂胶1份研技术有限公司)；DMEM培养基(Gibco)；小牛血清(中美合资碎，加入4份95％乙醇，置室温下浸渍24h，然后4℃冰箱冷兰州民海生物工程有限公司)；天然蜂胶(南京农业大学动物却，2500r／min离心10min，取上清液，即为纯化的蜂胶乙醇医学院提供)；25周龄伊莎蛋鸡20羽(溧水秋湖山生态养殖浸提液。根据蜂胶的纯度，计算出其中干物质的含量，配成基地提供)；PEG6000(Biosharp公司生产，南京博全科技分20mg／mL的溶

8、液，置4cC冰箱保存备用。(3)将灭活的病毒装)；96孔酶标板(上海生工生物技术有限公司)。液与蜂胶乙醇浸提液按体积比3：1混合，4℃保