黄芪山甲方对UUO模型大鼠TGF-β1、FN蛋白及mRNA表达的影响.pdf

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1、·616·合肾病杂志2014年7月第l5卷第7期CJITWN，July2014，Vo1．15，No．7黄芪山甲方对UUO模型大鼠TGF—l3、FN蛋白及mRNA表达的影响高艳霞①蔡宏瑜①杨光辉①万强①张娟①傅志慧①[摘要]目的：通过观察黄芪山甲(HQSJ)方对单侧输尿管结扎(unilateralureteralobstruction，UUO)模型中转化生长因子一131(transforminggrowthfactor—】，TGF—B1)、纤维黏连蛋白(fibronectin，FN)表达的影响，探讨HQSJ方抑制大鼠肾问质纤维化(renalinterstitialfibrosis，RIF)的机

2、制。方法：采用UUO大鼠模型，雄性SD大鼠30只随机分5组：假手术组(Sham)、模型组(UUO)、中药组(UUOA)、西药组(UUOE)、中西药组(UUOAE)。观察术后第28天光镜肾脏病理改变；采用分子生物学技术检测肾脏TGF—B和FN表达。结果：(1)与Sham组比较，UUO组肾小管问质损伤评分及TGF—B、FN表达明显增高(P<0．05)。(2)与UUO组比较，各治疗组第28天肾脏病理改变肾小管间质损伤评分及免疫组化TGF—p。、FN表达均有不同程度降低(P<0．05)，Westernblot法检测肾脏TGF—p1、FN蛋白和RT—PCR法检测肾脏TGF—B1、FNmRNA表达均有不

3、同程度下调(P<0．05)。(3)各治疗组间比较，UUOAE组病理改变减轻程度、TGF—p。、FN蛋白及mRNA表达下调幅度最大，UUOA组次之，UUOE组最小(P<0．05)，提示UUOAE组优于UUOA组，UUOA组优于UUOE组。结论：HQSJ方可通过下调UUO大鼠肾组织TGF—p。、FN的表达，减轻肾小管间质损伤，抑制RIF的进展。[关键词]HQSJ方RIFTGF—BFN肾间质纤维化(renalinterstitialfibrosis，RIF)是慢性肾脏病鼠取梗阻侧肾脏，保存标本待检。(chronickidneydisease，CKD)的主要病理基础之一，RIF程度3检测指标与肾功能

4、的相关性比肾小球硬化与肾功能的相关性更为密切，3．1免疫组化及肾间质损害病理评分肾组织石蜡切片是判断CKD预后的重要指标⋯。HQSJ方是全国名老中医孙常规处理后，微波修复，采用sP法免疫组化试剂盒，检测郁芝教授经验的总结，大量临床实践发现该方能减少蛋白尿，TGF—B，、FN表达，每张切片随机选取20个连续不重复视野改善肾功能并延缓CKD进展，本课题组前期动物实验已证(×200)，用图像分析软件来进行灰密度扫描，进行半定量分实，术后第14天HQSJ方可抑制RIF进展J。本实验拟采用析。肾间质损害病理评分：根据TBM增厚、肾小管萎缩、间质HQSJ方治疗，观察其对UUO大鼠肾组织TGF—B。和FN

5、的表纤维化、炎细胞浸润四个方面判定，每个参数按0～3分评定达，进一步探讨HQSJ方抑制大鼠RIF的机制。(0=正常，1：轻度损伤，2=中度损伤，3=重度损伤)。3．2Westernblot法检测TGF—Bl、FN蛋白的表达材料与方法50mg组织中加入0．5m1蛋白裂解液，超声匀浆，4cc条件下1材料清洁级雄性SD大鼠30只(山西省中医院动物10000g离心10min，取上清，加入等体积2×SDSbuffer，95℃中心提供)，平均体重为(246±16．2)g，TGF—B、FN抗体购于煮沸5rain，迅速冰浴，4℃条件下10000g离心10min，收集上武汉博士德生物有限公司，Trizol试剂

6、购于上海生工生物科技清。上清液15l在12％聚丙烯酰胺(SDS—PAGE)凝胶上电有限公司，采用Fermentas公司的逆转录(RT)试剂盒(K1622)泳，后转移至PVDF膜，5％BSA溶液，4℃封闭过夜，鼠源p—和Roche公司的FastStartUniversalSYBRGreenMaster(ROX)actin，1：1000稀释，4℃过夜，抗鼠二抗，1：10000稀释，室温孵荧光定量试剂盒(CAT．NO．04913850001，5m1)，抗TGF—Bl育2h，CL(pierce，KL140454)底物化学发光显色，显影，定影，抗体(se一31690)、FN抗体(SC一6953)、B—

7、actin抗体(sc一扫描。ImageJ凝胶图像分析仪进行信号分析，目的蛋白条带47778)由美国SANTACRUZ公司提供；HQSJ方具体组成：黄芪与内参条带的累积吸光度(A)比值为最终结果。40g、炮山甲5g、水蛭5g、六月雪5g、银花10g、大黄5g等组3．3RT—PCR检测TGF—B1、FN基因表达Tfizol试剂成，生药共计155g，由山西省中医院中药房提供。提取肾组织总RNA，逆转录生成cDNA，