半枝莲通过线粒体通路诱导小鼠肝癌细胞凋亡.ppt

《半枝莲通过线粒体通路诱导小鼠肝癌细胞凋亡.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、半枝莲提取物通过与caspase-3有关的线粒体通路诱导肝癌细胞H22细胞凋亡半枝莲是一种多年生草本植物，在中药中也被称为半枝莲。主要分布在华南地区，已被用作中国和韩国的肺癌，消化系统癌症，肝癌，乳腺癌和绒毛膜上皮瘤的抗肿瘤剂以及抗炎药和利尿剂。来自半枝莲的提取物(ESB)在体外对许多人类癌症（包括白血病，结肠癌，肝癌和皮肤癌）的生长有抑制作用。然而，其抗肿瘤机制仍不清楚。据报道，许多中草药具有抗癌特性，可以诱导细胞凋亡凋亡。现已经解决的三种凋亡途径，包括线粒体途径，死亡受体途径和内质网应激介导的细胞凋亡途径。在大多数生理和病理情况下，线粒体通路启动细胞

2、凋亡。吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析背景在线粒体启动的途径中，经历渗透性转换的线粒体将线粒体膜间隔的细胞色素C或细胞凋亡诱导因子的细胞凋亡蛋白释放到细胞溶质中。释放的细胞色素C可以激活caspase-9，并且激活的caspase-9反过来切割并激活子caspase-3。caspase-3激活后，caspase-3的某些特异性底物如聚（ADP-核糖）和聚合酶（PARP）被切割，最终导致细胞凋亡。吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析1.实验目的：研究半枝莲对肝癌细胞的生长抑制作用和它对肝癌细胞凋亡的影响确定半枝莲抑制小鼠肝癌细胞H22活性的机制。吴茱萸中二氢吴

3、茱萸新碱的定量分析2.实验材料与试剂吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析新鲜牛血清，RPMI-1640培养基，碘化丙啶（PI），二甲基亚砜（DMSO），核糖核酸酶（RNaseA），罗丹明123（Rh123），3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT），抗caspase-3和细胞色素C的小鼠单克隆抗体。凋亡细胞Hoechst33258检测试剂盒，荧光探针罗丹明123。体重220-250g的雄性SD大鼠。3.实验方法与结论，补吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析MTT法检测H22细胞增殖情况方法：将H22细胞在96孔板中以5×103个细胞

4、/孔的浓度接种，并在37℃下生长直到粘附。处理后，加入50μg/10μL的MTT，将细胞再孵育4小时。除去上清液后，向每个孔中加入200μLDMSO。振荡板10分钟后，使用酶标仪（EX-800型）测定90nm波长处的吸光度，检测细胞活力。细胞活力（％）=实验吸光度组/空白对照组吸光度×100％。H22细胞用不同剂量的ESB处理，分别在0,24,48,72和96h后评价H22细胞的生长速度。不同ESB治疗组H22细胞的细胞活力显着高于5-FU治疗组（图1），高剂量ESB明显抑制H22细胞增殖（P<0.05），低剂量ESB不能明显抑制H22细胞增殖（P>0.

5、05）。MTT测定显示高剂量和中等剂量的ESB以时间依赖的方式在体外抑制H22细胞的增殖。吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析形态学凋亡检测透射电子显微镜：用高度剂量的ESB处理粘附的H22细胞48小时。处理的细胞用胰酶消化，并在4℃预冷3％戊二醛固定2小时。载玻片制作部分，用PBS洗涤细胞，在1％的锇酸中固定另外1小时，在丙酮中脱水并包埋在环氧树脂中。用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，置Hitachi-800透射电子显微镜下观察。荧光显微镜：通过离心获得H22细胞，用PBS洗涤并在室温下在1％戊二醛中固定1小时。用PBS洗涤固定的细胞，用200μmol/LHo

6、echst33258染色10分钟。在荧光显微镜上观察用Hoechst33258染色的细胞核的变化。3.实验方法与结论高分辨率透射电子显微镜显示正常的H22细胞是圆形和规则的，在少数肿瘤细胞中具有染色质边缘（图2A）。在高ESB剂量治疗48小时后，部分核膜以尖锐的角度向外突出。H22细胞典型的凋亡形态出现如，在高ESB剂量组（图2B-D）中可以观察到细胞核的色素凝集和碎裂，软骨细胞肿胀，凋亡体形成。A：正常肝细胞H22细胞B：高ESB剂量组的核染色和色素凝集;C：高ESB剂量组凋亡小体D：高ESB剂量组的软骨细胞肿胀A：对照组B：低剂量治疗组C：中剂量治疗

7、组;D：高剂量治疗组用不同剂量的ESB治疗48h后，用Hoechst33258染色H22细胞在荧光显微镜下观察。凋亡细胞的染色质比正常细胞更亮。凋亡的特征，如核收缩，DNA缩合和分裂，在ESB治疗组中发现（图3B-D）。对照组、低ESB剂量组、高ESB剂量组凋亡细胞百分比分别为3.36％±2.14％，14.57％±4.28％，43.15％±5.33％，72.65％±6.52％。此外，凋亡细胞的数量以剂量依赖的方式逐渐增加。细胞周期分析H22细胞以5×105个细胞/孔在6孔板中孵育，用同源药物处理48小时。收集分离和附着的细胞，并在70℃冰冷的乙醇中于-2

8、0℃固定过夜。固定后，用PBS洗涤细胞，重悬于含有1mg/mL核糖核酸酶和50μ