骨形成蛋白对少突胶质祖细胞体外定向分化的影响.pdf

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1、·2164·广东医学2014年7月第35卷第14期GuangdongMedicalJournalJu1．2014，Vo1．35．No．14骨形成蛋白对少突胶质祖细胞体外定向分化的影响术陈丽萍，郭力，马顺利，张静，李振飞，姜红‘河北医科大学第二医院神经内科、河北省神经病学实验室(石家庄050000)；河北省邢台市第三医院神经内一科(054000)【摘要】目的观察体外培养的少突胶质祖细胞(OPCs)在不同定向分化培养基中骨形成蛋白(BMP)的表达，以及BMP的拮抗剂Noggin对OPCs定向分化的影响，进而探讨脱髓鞘疾病治疗的新靶点。方法选取新生1—2d

2、的sD大鼠，应用选择性分离程序，通过细胞选择性贴壁培养和不同频率的振荡，分离纯化OPCs，分别用无血清和有血清的定向分化培养基培养，并在定向分化培养基中给予Noggin干预。应用免疫荧光法进行细胞鉴定，观察细胞分化状况。用实时定量聚合酶链式反应(qRT—PCR)检测定向分化细胞的BMP2、BMP4mRNA的表达。结果纯化后的OPCs细胞达95％。在无血清的情况下，OPCs定向分化为少突胶质细胞；在有血清的情况下，定向分化为2一型星形胶质细胞，并且细胞BMP2／4mRNA表达增加。Noggin抑制OPCs向星形胶质细胞的分化。结论OPCs具有增殖和双向

3、分化的潜能。BMP2／4参与了OPCs定向分化的调控。【关键词】少突胶质祖细胞；定向分化；少突胶质细胞；星形胶质细胞；骨形成蛋白；多发性硬化在许多髓鞘损伤疾病，比如多发性硬化中，会出现的诱导分化培养：在OPCs铺满培养瓶后，进行细胞的髓鞘脱失，会引起患者的神经功能损伤。近年来，多发传代。传代后的OPCs分别给予定向培养的无血清培性硬化的治疗除了免疫调节治疗外，促进髓鞘再生的养基或血清培养基，观察细胞生长情况。OPCs在血清治疗也越来越受到重视。少突胶质细胞是中枢神经系培养基3～7d，分化为2一型星形胶质细胞；在无血清统的髓鞘形成细胞，来源于少突胶质祖

4、细胞(oligoden．培养基中培养3～5d，分化为少突胶质细胞。(3)BMPdrocyteprecursorcells，OPCs)。2013年1_7月，本研究拮抗剂Noggin干预实验：在含血清的培养液中加入探讨OPCs在体外培养条件下，骨形成蛋白(bonenor-Noggin(250rig／mL)后观察细胞生长分化情况。phogeneticprotein，BMP)信号系统在OPCs定向分化中1．5免疫细胞化学染色PBS洗涤收集后的细胞，的作用，并观察BMP拮抗剂Noggin对细胞分化的影响，4％多聚甲醛固定30min，按常规免疫荧光细胞化学方从而

5、为促进脱髓鞘疾病的髓鞘再生寻找新的治疗靶点。法进行标记，一抗为A2B5(OPCs)、星形胶质细胞1材料与方法(GFAP)、少突胶质细胞(MBP)。免疫荧光二抗应用FITC和CY5，Hoechst33342标记细胞核。PBS替代一1．1实验动物选取新生1～2d的Sprague—Dawly抗作阴性对照。大鼠共80只，雌雄不分，体重(7±0．5)g。由河北医科1．6实时定量聚合酶链式反应(qRT—PCR)用超纯大学实验动物中心提供。RNA提取试剂盒(CWbio．Co．Ltd，北京)提取各种培养1．2主要仪器超净工作台(SW—CJ一2FD，江苏苏条件下生长2

6、4h的OPCs样本中总RNA。实验操作按净)、CO：培养箱(SANYO，日本)、解剖显微镜(MOT．产品说明书进行。用HiFi—MMLVcDNA第一链合成Ic，德国)、37℃恒温摇床(世平，上海)、台式高速离心试剂盒(CWbio．Co．Ltd)进行反转录。应用AB7500荧机(Hettich，德国)、荧光倒置显微镜(OLYMPUS，Et光定量PCR仪进行qRT—PCR试验。采用2法本)、激光共聚焦显微镜(OLYMPUS，日本)、AB7500型进行数据的相对定量分析。用RealSuperMixture(withPCR仪(AppliedBiosystem

7、s，美国)PCR扩增仪(CW-Rox)(CWbio．Co．Ltd)进行扩增，实验操作按产品说明bio．Co．Ltd．，北京)。书进行。扩增程序为：95℃10min；95℃15S，60℃60S，1．3试剂鼠抗A2B5单抗(abcam)、兔抗多克隆胶4(】个循环。每个cDNA样品在96孔板均设置3个复质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(DAKO)、鼠抗髓鞘碱性孔。弓I物序列为：BMP2：5一GTAAAGGACATCcAcTc-蛋白(MBP)单抗(abcam)、BMP2、4(SantaCruz)，Nog．CACAAACG一3(上游)，5一GCCACGATCCA

8、GTCAT—gin(R&D)。免疫荧光二抗(FITC／CY5，Beyotime)、Ho．TCCACCC一3(