分子细胞遗传学技术

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1、分子细胞遗传学技术与产前诊断南京大学医学院王亚平2006年11月基因诊断的中心问题是认识遗传变异、基因突变及与表型之间的关系一、分子细胞遗传学技术荧光原位杂交技术（fluorescenceinsitehybridization,FISH）：用荧光物质标记特异性DNA探针，与中期细胞染色体或间期细胞核杂交，鉴别和确定出生缺陷、肿瘤细胞染色体异常，分辨率可达50－500kb.荧光原位杂交技术（Fluorescenceinsitehybridization,FISH）的特异性DNA探针基因座特异性探针：克隆扩增获得。在基因制图方面的努力，越来越多的这方

2、面探针可以使用着丝粒重复序列探针：这些特异性的探针可在中期染色体和间期细胞核中产生强烈信号，可以鉴别特异性染色体。全染色体涂染探针：通过对来自特异性染色体分检库或仅含一条人类染色体的杂种细胞DNA扩增制备。这种DNA序列的混合物与一条染色体上的多个位点同源。因此在中期核内，整条染色体得以被涂染。通过使用不同的荧光素，在一个中期染色体涂片上可以鉴别几条不同的染色体。应用15号染色体一基因特异性探针（红色）杂交确定其是否缺失；绿色探针鉴定15号染色体着丝粒。24种不同染色体涂染探针杂交得到的彩色染色体染色体技术的应用－1inv(14)(p12q24)t

3、(2;11)(2q34;11q13)细胞遗传学研究中染色体技术的应用—FISH技术检出t(2;14)染色体技术的应用－2inv(9)(p12q13)分子细胞遗传学：DMD基因第46号外显子缺失细胞遗传学研究中染色体技术的应用9号染色体涂染探针杂交。箭头示易位到10号染色体上的来自9号染色体的片段21号染色体涂染探针FISH杂交，显示21三体比较基因组杂交（comparativegenomichybridization,CGH）近年在FISH技术基础上发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术（1992，Kallioniemi）。其基本原理是用不同荧光物质

4、分别标记肿瘤细胞DNA和正常人细胞DNA，然后与正常人中期细胞染色体杂交。通过检测染色体上两种荧光信号的相对比值，了解肿瘤细胞DNA拷贝数的变化，并可在染色体上定位。这一技术已广泛应用于肿瘤基因组不平衡的检测。比较基因组杂交的原理待测DNA（肿瘤细胞DNA，testDNA)为绿色参照DNA(正常细胞DNA，referenceDNA）为红色复染为蓝色人食管鳞癌细胞株的比较基因组杂交中期染色体的DAPI的复染图B.中期染色体比较基因组杂交（CGH）：红色区域表示丢失，绿色区域表示扩增。CGH的优点：经一次染色体原位杂交实验即可在整条染色体或染色体区带水

5、平对待检基因组DNA序列拷贝数改变进行检测和定位。无需进行染色体培养，对于不易制备良好分裂相的实体瘤尤为适用。所需染色体DNA可来自各种组织，如新鲜组织、福尔马林固定的组织、石蜡包埋组织，可在很少量的基础上检测，利于做回顾性研究。CGH的局限性：难以检出以下异常：平衡易位，微小突变，基因重排，倍体水平改变。结果可能受到一些因素影响：正常细胞存在，肿瘤自身的遗传异质性，系统的波动。灵敏度：限于检测较大范围的缺失（10—30MB）二、突变分析与分子诊断（一）基因突变类型点突变：只有一个或几个核苷酸的改变，是突变中最多见的形式。稳定突变：传递中不改变原有

6、的突变。动态突变：传递中不断改变自己，多见于短重复序列的突变，在一代代传递中重复次数发生明显变化。点突变的结果：（1）同义突变（samesensemutation）：碱基替换后，虽然密码子发生改变，但编码氨基酸没有改变（遗传密码的兼并性），亦称静止突变。（2）错义突变（missensemutation）：碱基替换，密码子发生改变后，编码氨基酸亦发生改变，编码另一个氨基酸。（3）无义突变（nonsensemutation）：碱基替换后，使编码氨基酸的密码子变成一个终止密码子。（4）中性突变：包含两种情况，即“同义突变”和不改变蛋白质功能的“错义突变”

7、基因突变形式—碱基的插入和缺失碱基的插入和缺失：基因编码序列中插入或丢失一个或几个碱基，其结果是突变点下游碱基序列发生移码，编码氨基酸序列都发生改变，又称移码突变（frameshiftmutation），并可在突变点下游提前出现终止密码。碱基的插入和缺失的结果：将导致移码突变（frameshiftmutation），并可在突变点下游提前出现终止密码产生截短型蛋白缺失突变基因突变形式框内突变（inframemutation）：3个或是的倍数的碱基缺失或插入导致的突变，使基因丢失或增加1个或几个氨基酸。DNA大片段缺失或复制（largedeletion

8、orduplication)：几百个bp至几十个kb的碱基缺失或复制。各种类型病理性突变的比例无义突变和移码突变：60％稀