细胞和分子细胞遗传学技术

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1、细胞和分子细胞遗传学技术张亚丽(黑龙江省森工总医院150040)【中图分类号】R394.2【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2012)19-0151-02经典的细胞遗传学技术是指通过制备染色体标木，分析染色体数目和结构改变与人类疾病之间的关系。近代分子生物学技术与细胞遗传学技术相结合,形成了细胞和分子遗传学技术。其中比较成熟、具有实用价值的技术是：①荧光原位杂交；②比较基因组杂交。1人外周血淋巴细胞染色体检测技术人外周血淋巴细胞染色体检测属于经典的细胞遗传学技术。用作染色体分析的标木包括外周血、脐带血、羊水、胎盘绒毛组织和肿瘤组织等。外周血是应用

2、最多的材料。其他组织样木染色体制备方法与制备人外周血淋巴细胞的方法基木类同，只是标木的处理和培养条件有所调整。1.1基木原理体外培养的外周血淋巴细胞，在植物凝集素(PHA)的刺激下转化成为能进行有丝分裂的淋巴母细胞；在秋水仙素(纺锤体抑制剂)作用下，淋巴母细胞有丝分裂停滞，从而获得处于有丝分裂中期的淋巴细胞染色体标木。1.2基木操作程序⑴取血3ml(空针用0.1〜0.2ml肝素抗凝)。(2)用7号针头向每瓶培养液(内装有5ml培养液)接种血液标木15〜16滴，摇匀后，静置于37°C的隔水式恒温培养箱中培养72h。(3)终止培养前3h，用7号针头向培养瓶中加入秋

3、水仙素3滴(浓度为20μg/ml｝并混匀。(4)按以下程序制片。①收集细胞.•由培养瓶中吸取培养物10ml置于离心管中，离J〜,10min(l500〜2000r/min)离心后，弃上清液，留下沉淀物。①低渗处理沉淀物：向沉淀物中加入己预温(37°C)的KCI(0.075mol/L)8ml,充分吹打，以使细胞分散，并将离心管置于37°C水浴中20〜30min。②固定沉淀物：向每只离心管中加入新鲜配制的甲醇一冰醋酸(3:1)固定液1〜2ml(预固定)，轻轻混匀后离心10min(2500r/min),去上清液，留沉淀物；向每只离心管中再加上述固定液8ml，轻轻

4、混匀后静置30min以上，离心10min(2500r/min)；然后，再重复固定、离心1次。③制作标本片：尽量弃去离心管中的上清液，用吸管轻轻吹打苏中的沉淀物，再加入6〜7滴新鲜的固定液并混匀，然后，将该沉淀物滴加于已经预冷的载玻片上(预冷载玻片：将清洁载玻片放在盛冇蒸馏水的小搪瓷盆中置于4"C冰箱中数小吋以上)；将标本片晾干后，置于75°C烤箱中烘烤2.5h,然后自然冷却，也可将标本片吹干后用火焰烘干。④标本片染色：用Giemsa染液(以pH7.4的磷酸缓冲液配制，1.10)染色lOmin,自来水冲净并晾干。⑤显微镜观察:低倍镜下，选择标本片中染色体分散好、

5、无细胞质背景、处于中期核分裂的培养细胞；然后，在高倍镜、油镜下观察染色体形态，进行计数、分组和性别鉴定；拍摄照片以进行正确的核型分析，并将典型图片存档。可根据需要进行染色体的Q显带、G显带、C显带、R显带和T显带。1.3注意事项PHA是体外细胞培养成败的关键因素，其应用浓度应根据各批号PHA的效价作适当调整。秋水仙素的浓度和作用时间影响标本的分析。浓度低或作用时间短，会使标本中的分裂细胞减少；浓度高或作用吋间长，会使染色体过于缩短，以致形态特征模糊。采血和接种培养吋，不要加入过多肝素，肝素过多可抑制淋巴细胞转化。显带检测，以存放3d左右的标本片效果较好。观察G

6、显带吋，检材要用胰酶液消化。消化液的配制和消化条件的控制要认真探索，以获得最佳结果。2荧光原位杂交技术(FISH)2.1基本原理2.1.1原位杂交是用标记了己知序列的核苷酸片段作为探针，通过核酸杂交，直接在组织切片（冷冻切片或石蜡切片）、细胞涂片、染色体制备标本或培养细胞爬片上，检测或定位某一特定的0的DNA或0的RNA的存在。2.1.2FISH是以荧光素标记己知序列的核苻酸片段（探针），通过检测荧光来定性和定位目的核酸片段，具冇敏感、快速、能向吋显示多种颜色等优点，不但能显示中期核分裂象的染色体，还能检测间期细胞核的DNA。（1）FISH的直接法：以荧光素直

7、接标记DNA探针，特异性强，方法简便。随着荧光标记技术的改进，直接法的敏感性不断提高，是0前常用的方法。（2）FISH的间接法：以非荧光素标记物标记DNA探针，再桥连一个荧光标记抗体。2.2基本方法2.2.1探针和试剂。用于FISH的探针有不同类型。己有商品化的探针用于FISH。avidin-FITC、anti-avidin和PI等检测试剂均可购得。2.2.2原位杂交。杂交前标本和探针应经变性处理。2.2.3检测。杂交后的标本除去封胶，置2×SSC中洗去盖片。经多步骤漂洗后依次在亲和素一荧光素、抗亲和素抗体和亲和素一荧光素中各孵育20min（生物素

8、标记探针），其间及其后各用l&time